鴨骨泥酶解條件的優(yōu)化

丁安子，吳文錦，李　新，喬　宇，廖　李，王　俊，汪　蘭

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)

科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064)

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鴨骨泥酶解條件的優(yōu)化

丁安子，吳文錦，李新，喬宇，廖李，王俊，汪蘭

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)

科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064)

摘要：以鴨骨泥為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最適用酶，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件。結(jié)果表明：最適用酶為廣州華琪的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，在復(fù)合蛋白酶添加量為0.6%、水解時(shí)間為2 h、風(fēng)味蛋白酶添加量為0.8%、水解時(shí)間為1 h、酶解溫度為50 ℃、pH值為7.0、料液比為1∶1(g∶mL)的最佳酶解條件下，鴨骨泥的水解度為33.5%。

關(guān)鍵詞：鴨骨泥；酶解；水解度

近年來，我國水禽(鴨、鵝、雁等)養(yǎng)殖加工體系發(fā)展迅速，水禽養(yǎng)殖量、加工量已連續(xù)多年領(lǐng)銜世界第一[1]。中國肉鴨作為水禽體系中的重要組成部分，品質(zhì)高、價(jià)格低、國際競爭力強(qiáng)，其屠宰量約占世界總產(chǎn)量的73%[2]，且呈逐年遞增趨勢。2005～2013年，全國肉鴨出欄量由18.04億只增至30.65億只，產(chǎn)肉量由235.01萬t增至613.09萬t，年均增長速度5%~8%[3]。

根據(jù)加工需求，肉鴨被宰殺成白條鴨用于烤鴨、醬板鴨生產(chǎn)；或精細(xì)分割進(jìn)一步增值，如：頭、舌、脖、掌、胸肉、翅根、鎖骨等高附加值部位加工制成醬鹵休閑制品，在此過程中產(chǎn)生大量附加值極低的鴨骨架，僅能用于提取骨膠或磨制成飼料。因此，研究鴨骨架新產(chǎn)品新工藝，對提高肉鴨屠宰產(chǎn)物附加值，進(jìn)一步增強(qiáng)我國肉鴨國際競爭力，提高養(yǎng)殖戶收入具有重要意義。

研究表明，鴨骨泥(粉碎磨細(xì)后的鴨骨架)中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.82%~29.19%[4-5]，可與肉相媲美。必需氨基酸、鮮味氨基酸、含硫氨基酸含量均較高[6]，這些都是制備鴨肉風(fēng)味美拉德反應(yīng)調(diào)味料的前體物質(zhì)。

酶解是利用內(nèi)切酶或外切酶對大分子蛋白質(zhì)在溫和條件下進(jìn)行處理，得到小分子目標(biāo)產(chǎn)物的過程。康從民等[7]、王玉敏等[8]分別利用酶解技術(shù)對鳀魚和大豆粕進(jìn)行加工利用。目前，多采用堿性蛋白酶對鴨骨泥進(jìn)行酶解利用[9-14]，存在酶解液中伴隨有程度不一的苦味等問題。作者參考雞骨泥復(fù)合酶解工藝[15]，采用不同來源的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對鴨骨泥進(jìn)行酶解，確定最佳酶解工藝，為開發(fā)鴨肉風(fēng)味美拉德反應(yīng)調(diào)味料提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

鴨骨架由湖北鴻翔農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，為36日齡櫻桃谷鴨。鴨骨架采用凍肉絞肉機(jī)絞碎混勻，分裝成30g·袋-1，-18 ℃保存，備用，使用前流水解凍。

Protamex、Flavourzyme，Novozymes公司；復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，廣州華琪生物科技有限公司；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、硫酸、硼酸、硫酸鉀、福林試劑、酪蛋白，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；FE20/EL20型酸度計(jì)，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；可見分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；電子天平，奧多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；凍肉絞肉機(jī)，諸城利欣食品機(jī)械有限公司。

1.2　方法

1.2.1蛋白質(zhì)含量的測定

采用凱氏定氮法[16]測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.2蛋白質(zhì)水解度的測定

水解度，指水解斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比，是衡量蛋白質(zhì)水解程度的一個(gè)重要指標(biāo)。水解斷裂的肽鍵數(shù)可通過水解釋放出的氨基氮來測定，然后按下式計(jì)算水解度：

1.2.3氨基酸態(tài)氮的測定

采用甲醛滴定法[17]測定氨基酸態(tài)氮。

1.2.4酶解單因素實(shí)驗(yàn)

由于復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶均為中性蛋白酶復(fù)配，根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的數(shù)據(jù)，它們的最適酶解溫度均為50 ℃，最適酶解pH值均為7.0。因此，在單因素實(shí)驗(yàn)中無需對酶解溫度、pH值進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.1酶添加量對水解度的影響

稱取30 g鴨骨泥于250 mL錐形瓶中，選擇Protamex、Flavourzyme、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種酶分別進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。設(shè)定酶添加量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為4 h，pH=7.0，料液比(g∶mL，下同)為1∶1。酶解結(jié)束后測定樣品的水解度，研究酶添加量對酶解效果的影響，選擇最佳酶添加量。

1.2.4.2酶解時(shí)間對水解度的影響

稱取30 g鴨骨泥于250 mL錐形瓶中，選擇Protamex、Flavourzyme、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種酶分別進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。設(shè)定酶解時(shí)間為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.7%，pH=7.0，料液比為1∶1。酶解結(jié)束后測定樣品的水解度，研究酶解時(shí)間對酶解效果的影響，選擇最佳酶解時(shí)間。

1.2.4.3料液比對水解度的影響

稱取30 g鴨骨泥于250 mL錐形瓶中，選擇Protamex、Flavourzyme、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種酶分別進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。設(shè)定料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.7%，酶解時(shí)間為4 h，pH=7.0。酶解結(jié)束后測定樣品的水解度，研究料液比對酶解效果的影響，選擇最佳料液比。

1.2.5酶解正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到單一酶的最適酶添加量、酶解時(shí)間和料液比，綜合評定，選擇最佳的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行組合，以水解度為考核指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確定雙酶法酶解鴨骨泥的最佳工藝條件。

2結(jié)果與討論

2.1　酶添加量對水解度的影響(圖1)

圖1　酶添加量對水解度的影響

由圖1可看出，在一定范圍內(nèi)，隨著復(fù)合蛋白酶添加量的增加，鴨骨泥水解度逐漸上升，當(dāng)添加量達(dá)到0.5%時(shí)，曲線上升速率逐漸變緩；當(dāng)添加量為0.7%時(shí)，達(dá)到最高水解度，為29.3%。原因可能是酶解反應(yīng)初期，底物-酶相互作用未達(dá)到飽和，隨著酶添加量的增加，反應(yīng)底物能夠更大程度地被消耗。當(dāng)達(dá)到最佳添加量時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到最大。但隨著添加量的進(jìn)一步增大，水解度呈下降趨勢，可能是由于酶濃度過高，在底物量一定的條件下，反應(yīng)受到抑制，鴨骨泥不能被完全水解，導(dǎo)致水解度下降。隨著風(fēng)味蛋白酶添加量的增加，鴨骨泥的水解度逐漸增大，添加量為0.8%時(shí)，水解度達(dá)到最高，可達(dá)25.4%，繼續(xù)增大酶添加量，水解度反而下降。Protamex、Flavourzyme在添加量0.1%~0.8%范圍內(nèi)，鴨骨泥水解度整體呈上升趨勢，但存在一定的波動(dòng)性；在添加量為0.8%時(shí)，鴨骨泥的水解度均達(dá)到最高，分別為25.9%和21.7%，其后水解度有所降低。

綜合酶添加量對鴨骨泥水解度的影響可知，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶最適添加量分別為0.7%、0.8%；Flavourzyme和Protamex最適添加量均為0.8%。

2.2　酶解時(shí)間對水解度的影響(圖2)

圖2　酶解時(shí)間對水解度的影響

由圖2可看出，在一定的酶解時(shí)間范圍內(nèi)，復(fù)合蛋白酶對鴨骨泥的水解呈迅速上升的趨勢，在4 h時(shí)水解度最大，之后趨于平緩。隨著酶解時(shí)間的延長，風(fēng)味蛋白酶對鴨骨泥的水解同樣呈上升趨勢。原因可能是剛開始酶解時(shí)，鴨骨泥呈飽和狀態(tài)，遵循零級反應(yīng)，隨著酶解時(shí)間延長，酶能更充分地與底物接觸，水解度直線上升；但當(dāng)酶解時(shí)間超過3 h后，水解度上升速率變緩；Protamex、Flavourzyme對鴨骨泥的水解呈整體上升的趨勢，剛開始較平穩(wěn)，2 h以后水解度顯著提高；當(dāng)Protamex酶解時(shí)間超過4 h、Flavourzyme酶解時(shí)間超過3 h后，水解度上升趨勢變緩。

雖然酶解超過4 h后水解度仍上升，但存在水解液風(fēng)味變差[18]、感染雜菌風(fēng)險(xiǎn)增加、生產(chǎn)時(shí)間成本增加等問題。綜合考慮，確定復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶最適酶解時(shí)間分別為4 h、3 h；Flavourzyme和Protamex最適酶解時(shí)間均為4 h。

2.3　料液比對水解度的影響(圖3)

圖3　料液比對水解度的影響

由圖3可看出，隨著料液比的增大，鴨骨泥的水解度迅速下降，當(dāng)料液比超過1∶3之后，水解度下降速率普遍變緩。原因是在料液比為1∶1時(shí)，4種酶的濃度最大，更多的酶分子能與底物結(jié)合，有利于與鴨骨泥的反應(yīng)，所以水解程度最大。故確定最佳料液比為1∶1。

2.4　正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對鴨骨泥的水解能力優(yōu)于Flavourzyme和Protamex。故選擇復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行組合，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確定雙酶法酶解鴨骨泥的最佳工藝條件。

固定酶解溫度為50 ℃、pH=7.0、料液比1∶1，以復(fù)合蛋白酶添加量、復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間、風(fēng)味蛋白酶添加量、風(fēng)味蛋白酶水解時(shí)間為考察因素，以水解度為考核指標(biāo)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1　Factors and levels of orthogonal experiment

從表2可以看出，各因素對水解度的影響主次順序?yàn)锳>B>C>D，即復(fù)合蛋白酶添加量>復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間>風(fēng)味蛋白酶添加量>風(fēng)味蛋白酶水解時(shí)間。最適宜的工藝參數(shù)為A2B1C3D1，即復(fù)合蛋白酶添加量為0.6%、水解時(shí)間為2 h，風(fēng)味蛋白酶添加量為0.8%、水解時(shí)間為1 h。

表2正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

Tab.2　Results and analysis of orthogonal experiment

2.5　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳工藝參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，鴨骨泥的水解度為33.5%，略高于實(shí)驗(yàn)4數(shù)據(jù)。說明正交實(shí)驗(yàn)的因素影響主次順序結(jié)論正確，該工藝條件可行。

3結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定酶解鴨骨泥的最適酶為廣州華琪的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。固定酶解溫度為50 ℃、pH=7.0、料液比1∶1(g∶mL)，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件為：復(fù)合蛋白酶添加量0.6%、水解時(shí)間2 h、風(fēng)味蛋白酶添加量0.8%、水解時(shí)間1 h，在此最佳條件下鴨骨泥的水解度為33.5%。

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Optimization of Enzymolysis Conditions of Duck Bone Mud

DING An-zi,WU Wen-jin,LI Xing,QIAO Yu,LIAO Li,WANG Jun,WANG Lan

(InstituteofAgriculturalProductsProcessingandNuclear-AgriculturalTechnology,

FarmProductsProcessingResearchSub-CenterofHubeiInnovationCenterofAgricultural

ScienceandTechnology,HubeiAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan430064,China)

Abstract：Using duck bone mud as a raw material,suitable enzymes were selected by single factor experiment.Then the enzymolysis conditions were optimized by orthogonal experiment.Results showed that,the most suitable enzymes for enzymolysis of duck bone mud were compound protease and flavor protease from Guangzhou Huaqi.When the dosage of compound protease was 0.6% with hydrolysis time of 2 h,and dosage of flavor protease was 0.8% with hydrolysis time of 1 h,enzymatic temperature was 50 ℃,pH value was 7.0,solid-liquid ratio was 1∶1(g∶mL),the hydrolysis degree of duck bone mud was 33.5%.

Keywords：duck bone mud;enzymolysis;hydrolysis degree

中圖分類號：TQ 936.22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1672-5425(2016)01-0049-04

作者簡介：丁安子(1982-)，男，湖北荊門人，碩士，工程師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工和食品風(fēng)味分析，E-mail：anzi.d@163.com；通訊作者：汪蘭，博士，副研究員。

收稿日期：2015-11-15

基金項(xiàng)目：湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心資助項(xiàng)目(2014-620-007-001)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.012