葛根藥材中化學成分HPLC指紋圖譜研究

黃 芳 祝婧云 梁新麗

(1 張家港市中醫醫院，蘇州，215600； 2 南昌大學第四附屬醫院，南昌，330004； 3 江西中醫藥大學，南昌，330004)

葛根藥材中化學成分HPLC指紋圖譜研究

黃 芳1祝婧云2梁新麗3

(1 張家港市中醫醫院，蘇州，215600； 2 南昌大學第四附屬醫院，南昌，330004； 3 江西中醫藥大學，南昌，330004)

目的：探索研究建立葛根高效液相指紋圖譜的方法與條件，以更好地控制葛根質量。方法：Agilent1260高效液相色譜儀；kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，E63848，25 cm)色譜柱；流動相：A-乙腈；B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃，檢測波長為250 nm，探索研究了葛根藥材以及提取物指紋圖譜。結果：運用梯度洗脫法得到的色譜圖各色譜峰分離較好，達到指紋圖譜要求，初步建立了葛根的指紋圖譜。結論：HPLC指紋圖譜法使用方法不同，所得到的圖譜結果也會有所不同，可根據最后所得到的理想指紋圖譜來斷定高效液相的最佳使用條件方法。

葛根藥材；HPLC；質量

葛根(Luerariae Lobatae Radix)為豆科植物野葛(PuerarialobataWilld Ohwi)的干燥根，主產于湖南、河南、廣東、浙江等地，秋冬季采挖，趁鮮切成厚片或小塊，干燥[1]。其被收載于《中華人民共和國藥典》各版。葛根性涼，味甘、辛，解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經活絡，解酒毒[1]。各版的藥典中規定葛根中的葛根素為該藥材質量控制的重要成分，但是鑒于針對中藥材或中成藥的真正質量和療效并不能因為某一個有效成分而得到完全保證，故而，目前使用指紋圖譜技術已然成為能夠被國際公認的控制中藥和天然藥物質量的最有效的手段[2-7]。結合各版藥典中葛根素為其控制的有效成分以及指紋圖譜在中藥和天然藥物質量控制中的作用和地位來開展中藥材葛根中化學成分的指紋圖譜方法研究。目前，文獻報道的有關葛極藥材指紋圖譜的研究中，大多葛根素成分與其他成分很難分開[8-9]。作者參考相關文獻[10-12]，通過實驗考察不同洗脫條件下的指紋圖譜中各成分的分離情況，來建立中藥材葛根高效液相指紋圖譜，以作為評價和控制中藥葛根原藥材內在質量的標準。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 色譜儀器為Agilent 1260高效液相色譜儀(自動進樣器)，DAD檢測器；SHB-III循環式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 藥物及試劑 葛根素對照品(中國藥品生物制品檢測所，批號為101765-200408)，乙腈為色譜純，水為雙蒸水,其他試劑均為分析純。用于指紋圖譜的10批藥材葛根飲片購自精華制藥亳州康普有限公司(產地安徽霍山縣葛根基地)。10樣品批號見表1。

表1 樣品批號

1.3 研究方法

1.3.1 梯度條件的優化 色譜柱為kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，25 cm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脫；考察乙腈起始濃度、終點濃度及梯度洗脫時間。流速為1.0 mL/min；檢測波長為250 nm；柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL[13]。梯度洗脫考察見表2。色譜圖見圖1～圖4。結果表明0～40 min，乙腈濃度由10%～30%梯度洗脫，葛根提取液各色譜峰均能夠得到較好的分離，即表2中方法4。

1.3.2 對照品配制 精密稱取葛根素對照品適量，用甲醇稀釋成每1 mL含100 μg的溶液，作為對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取各批葛根飲片50 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加加10倍量雙蒸水加熱回流提取3 h，共提取3次，合并3次提取液，0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

表2 梯度洗脫條件考察

1.3.4 指紋圖譜的建立

1.3.4.1 測定方法 分別精密量取葛根素對照品溶液和各供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按0～40 min，乙腈濃度由10%～30%，0.1%磷酸水由90%～70%梯度洗脫，記錄40 min色譜圖即得。對照品色譜圖見圖5，供試品色譜圖見圖4。以葛根素的色譜峰(s)的保留時間和峰面積為1，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積比值。

圖1 方法1葛根指紋圖譜

圖2 方法2葛根指紋圖譜

圖3 方法3葛根指紋圖譜

圖4 方法4葛根指紋圖譜

1.3.4.2 精密度試驗 以葛根藥材A(批號20141104)為供試品，精密吸取供試品溶液，連續進樣6次，測得共有峰11個，各共有峰相對峰面積的RSD均<5%，結果表明精密度良好。

1.3.4.3 重復性試驗 取A號樣品6份，精密稱定，制備供試品溶液，分別進樣，測得各共有峰相對峰面積的RSD均<5%，結果表明其重復性較好。

1.3.4.4 穩定性試驗 取A號葛根供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12進樣，測得共有峰相對峰面積的RSD均<5%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

表3 10批樣品共有指紋峰相對保留時間

表4 10批樣品共有指紋峰相對峰面積

圖5 A葛根HPLC指紋圖譜 B葛根素對照品

2 指紋圖譜分析與評價

2.1 共有指紋峰的標定 根據10批供試品溶液HPLC色譜提供的相關參數，比較各批樣品的色譜圖，其中共有峰11個(圖5)。其中5號峰為葛根素的色譜峰。

表5 10批樣品共有指紋峰峰面積

2.2 共有指紋峰面積比 共有峰的峰面積、相對保留時間、相對峰面積：5號峰為葛根素，是葛根中的主要有效成分，其峰面積占總峰面積的48.3%，比較穩定，因此，可以以其作為參照峰。共有峰相對保留時間和峰面積見表3、表4、表5。由表3、表4可知10批樣品間各共有峰相對保留時間RSD<5%，相對峰面積峰1、2、4、9、10RSD>5%。表5結果表明，共有峰總面積上總峰面積的平均百分數為92.87%，RSD為1.86%,符合批紋圖譜的有關規定。

3 討論

本實驗采用的是乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫法，能夠使葛根中的大部分黃酮類化合物(即中藥材葛根的主要有效成分)得到較好的分離[14]，因此得到了較完整的HPLC色譜圖。本實驗方法精密度和重現性都很好，因此可以用來研究葛根化學成分HPLC指紋圖譜法出峰時間以及出峰質量，可以更好地鑒別野葛的各種品種的真偽和各種不同產地，不同類別葛根藥材的內在質量的優劣。

從指紋圖譜看，方法1和方法2出峰時間快，但色譜圖中很多峰未能較好的分離。方法3出峰時間也較短，出峰質量較之方法1和方法2有了提高，但方法3中葛根素峰與其他峰未較好的分離。方法4出峰質量最好，很清晰，能夠將各個峰很好地分離，對于葛根質量的控制有很大的保證。

本實驗探討研究應用不同的方法，來獲得中藥材的指紋圖譜，探究了更加簡便、更加可靠，可以用于大力推廣的正確方法。為以后的實際運用提供切實可靠易行的參考方法。

[1]康廷國.中藥鑒定學[M].9版.北京:中國中醫藥出版社,2014,4(3):113，115.

[2]郭方遒.基于化學計量學的指紋圖譜技術及其用于復雜分析體系的表征和分析[D].長沙:中南大學,2004.

[3]李守信,展金祥,劉武占,等.基于指紋圖譜的金銀花物質組純化工藝研究[J].中草藥,2015,46(1):55-60.

[4]鐘可,王文全,靳鳳云,等.知母的HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J].中草藥,2016,47(15):2747-2750.

[5]李強,杜思邈,張忠亮,等.中藥指紋圖譜技術進展及未來發展方向展望[J].中草藥,2013,44(22):3095-3104.

[6]祝明,陳碧蓮,石上梅.中藥指紋圖譜技術在中國藥典2015年版一部中的應用[J].中國現代應用藥學,2016,33(5):611-614.

[7]陳林偉,秦昆明,徐雪松,等.中藥指紋圖譜數據庫的研究現狀及展望[J].中草藥,2014,45(21):3041-3047.

[8]曹瑞敏.中藥指紋圖譜及其在中藥質量控制中的應用[J].中國藥房,2004,15(10):635-636.

[9]張信青,蔣孟良,崔淑芬,等.淺談指紋圖譜在中藥飲片質量控制中應用的可行性[J].中醫藥導報,2005,11(3):55-58.

[10]方起程,林茂,孫慶民,等.葛根黃酮的研究[J].中華醫學雜志,1974(5):271.

[11]王春蘭,陳建民.梯度反相HPLC法測定葛根中5種異黃酮含量[J].藥物分析雜志,1995，15(supple):292.

[12]苗明三.現代實用中藥質量控制技術[M].北京:人民衛生出版社,2000:172.

[13]陳士林,陳四保,楊大堅,等.葛根高效液相指紋圖譜的研究[J].中草藥,2003,34(7):661-663.

[14]尤春雪,張振秋,李峰,等.HPLC波長切換技術對葛根中8種成分的測定及指紋圖譜研究[J].中草藥,2013,44(5),616-621.

(2016-05-19收稿 責任編輯：張文婷)

Study on HPLC Fingerprint Analysis on Chemical Composition of Radix Puerariae

Huang Fang1, Zhu Jingyun2, Liang Xinli3

(1TraditionalChineseMedicineHospitalofZhangjiagang,Zhangjiagang215600,China; 2ThefourthAffiliatedHospitalofNanchanguniversity,Nanchang330004,China; 3KeyLaboratoryofModernPreparationofTCMofMinistryofEducation,JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330004,China)

Objective:To study the method and condition for HPLC fingerprinting of Radix Puerariae, in order to better control the quality of herbal medicine. Methods:Agilent 1260 by high performance liquid chromatograph was applied and kromasil 100-5C18(4.6 mmx250 mm, E63848, 25 cm) chromatographic column was established. The mobile phase was A-acetonitrile and B-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution and velocity was set as 1 mL/min with the column temperature for 30 ℃. The detection wavelength was 250 nm to explore and study Radix Puerariae extracts of medicinal herbs as well as fingerprints. Results:Separation in each chromatographic peak of obtained chromatogram by the above method was great, meeting the requirements to fingerprints. The fingerprint for Radix Puerariae was preliminary established. Conclusion:As different HPLC fingerprint methods are applied, the map results will vary. The optimal use and ideal conditions of high performance liquid chromatography method can be summarized based on the result of the best fingerprints.

Radix Puerariae; HPLC; Quality

國家自然科學基金青年基金項目(編號：81303237)——白芷促進P-gp介導活性成分吸收的物質基礎及機理研究

黃芳(1977.11—)，女，本科，主管中藥師，研究方向：藥劑學研究工作，E-mail:huangfang@126.com

祝婧云(1986.11—)，女，碩士，主管中藥師，研究方向：藥劑學研究工作，E-mail:paln7@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.069