接骨丸對(duì)SD骨折大鼠血清鈣、ALP、CD3、CD44表達(dá)的影響

金 朗 王 雪 王炳強(qiáng)

(1 河北省滄州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，滄州，061001； 2 河北省滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，滄州，061001；3 河北省滄州市婦幼保健院藥劑科，滄州，061001)

接骨丸對(duì)SD骨折大鼠血清鈣、ALP、CD3、CD44表達(dá)的影響

金 朗1王 雪2王炳強(qiáng)3

(1 河北省滄州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，滄州，061001； 2 河北省滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，滄州，061001；3 河北省滄州市婦幼保健院藥劑科，滄州，061001)

目的：探討接骨丸對(duì)SD骨折大鼠血清鈣、ALP、CD3、CD44表達(dá)的影響。方法：SD大鼠40只按照數(shù)字隨機(jī)表法將其分為4個(gè)組(對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組)，每組10只。模型組、低劑量組和高劑量組給予造模。對(duì)照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃；低劑量組灌胃濃度為0.4 g/kg濃度的接骨丸溶液、高劑量組灌胃濃度為1.6 g/kg的接骨丸溶液。結(jié)果：模型組、低劑量組、高劑量組治療1周和2周血清鈣、ALP、CD3、CD44水平低于對(duì)照組，模型組、低劑量組治療3周血清鈣、ALP、CD3、CD44水平低于對(duì)照組，而高劑量組治療3周血清鈣、ALP、CD3、CD44水平高于對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組和高劑量組治療4周血清鈣、ALP、CD3、CD44水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周血清鈣、ALP、CD3、CD44水平高于低劑量組(P<0.05)。結(jié)論：接骨丸可能通過增加血清鈣、ALP、CD3、CD44表達(dá)水平，促進(jìn)骨折愈合。

接骨丸；SD骨折大鼠；血清鈣；ALP；CD3；CD44

骨折是常見的一種臨床骨科疾病。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)隨著車禍、高處墜落的不斷上升，從而使得四肢骨折發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。骨折后容易發(fā)生不同程度的腫脹和疼痛等癥狀，且容易導(dǎo)致骨折不愈合等，嚴(yán)重影響患者日常生活和預(yù)后[3-4]。骨折愈合是極其復(fù)雜的一個(gè)生物學(xué)修復(fù)過程，受諸多因素的影響[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨折愈合以及治療研究已逐漸進(jìn)入生物學(xué)和細(xì)胞分子水平，為骨折的理論研究及應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)[6]。本研究旨在分析接骨丸對(duì)SD骨折大鼠血清鈣、ALP、CD3、CD44表達(dá)的影響，為臨床提供一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠40只，體重100～120 g，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食、飲水，維持室溫為23～25 ℃，相對(duì)濕度70%。按照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑中接骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)于實(shí)驗(yàn)室接骨丸，接骨丸(河北萬(wàn)歲藥業(yè)有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：131201)，粉碎至一定細(xì)度，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為4個(gè)組(對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組)，每組10只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備[7]各組大鼠均以100 g/L水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司生產(chǎn)；生產(chǎn)批號(hào)：37022673；300 mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物，給大鼠以俯臥位進(jìn)行固定，常規(guī)消毒，無(wú)菌操作，然后采用外側(cè)切口，經(jīng)股前、外側(cè)肌間隔分離至股骨，除對(duì)照組外，其余各組大鼠采用低速牙科鉆在股骨中斷切斷股骨，再利用克氏針?biāo)枨荒嫘泄潭ǎ饘涌p合，再給以無(wú)菌包扎，均手術(shù)成功。對(duì)照組不切斷股骨，其余步驟同上。

1.3.2 給藥方法 對(duì)照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃；低劑量組灌胃濃度為0.4 g/kg濃度的接骨丸溶液(相當(dāng)于臨床用藥的8倍)、高劑量組灌胃濃度為1.6 g/kg的接骨丸溶液(相當(dāng)于臨床用藥的32倍)。每組小鼠均按照1 mL/100 g(小鼠體重)劑量給藥。

1.4 觀察指標(biāo) 1)觀察各組大鼠組織病理情況；2)觀察各組大鼠于治療1周、2周、3周、4周血清鈣水平變化，于大鼠眼底取血，制備血清，測(cè)定血清鈣含量；3)觀察各組大鼠于治療1周、2周、3周、4周血清ALP水平變化；于大鼠眼底取血，制備血清，測(cè)定ALP含量；4)觀察各組大鼠CD3表達(dá)水平變化；5)觀察各組大鼠CD44表達(dá)水平比較。

2 結(jié)果

2.1 各組X線片觀察大鼠骨折及病理組織 模型組和各劑量組大鼠術(shù)后骨折端斷為血腫組織所填充，且于大鼠骨折后1周形成肉芽組織，于大鼠骨折后2周骨折端形成大量纖維性骨痂，于大鼠骨折后3周有散在骨小梁形成，于大鼠骨折后4周能夠清晰可見骨小梁，且各劑量組于4周明顯優(yōu)于模型組。對(duì)照組大鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)均正常。X線片觀察大鼠骨折情況見圖1，病理組織變化情況見圖2。

圖1 X線片大鼠骨折愈合情況

圖2 病理組織變化(×400)

2.2 各組大鼠血清鈣水平比較 模型組、低劑量組、高劑量組治療1周和2周血清鈣水平低于對(duì)照組，模型組、低劑量組治療3周血清鈣水平低于對(duì)照組，而高劑量組治療3周血清鈣水平高于對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組和高劑量組治療4周血清鈣水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周血清鈣水平高于低劑量組(P<0.05)。說明接骨丸可明顯增加血清鈣水平，且呈劑量依賴性。見表1。

2.3 各組大鼠ALP水平比較 模型組、低劑量組、高劑量組治療1周和2周血清ALP水平低于對(duì)照組，模型組、低劑量組治療3周血清ALP水平低于對(duì)照組，而高劑量組治療3周血清ALP水平高于對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組和高劑量組治療4周血清ALP水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周血清ALP水平高于低劑量組(P<0.05)。說明接骨丸可明顯增加血清ALP水平，且呈劑量依賴性。見表2。

2.4 各組大鼠CD3表達(dá)水平比較 模型組、低劑量組、高劑量組治療1周和2周CD3表達(dá)水平低于對(duì)照組，模型組、低劑量組治療3周CD3表達(dá)水平低于對(duì)照組，而高劑量組治療3周CD3表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組和高劑量組治療4周CD3表達(dá)水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周CD3表達(dá)水平高于低劑量組(P<0.05)。說明接骨丸可明顯增加CD3表達(dá)水平，且呈劑量依賴性。見表3。

2.5 各組大鼠CD44表達(dá)水平比較 模型組、低劑量組、高劑量組治療1周和2周CD44表達(dá)水平低于對(duì)照組，模型組、低劑量組治療3周CD44表達(dá)水平低于對(duì)照組，而高劑量組治療3周CD44表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組和高劑量組治療4周CD44表達(dá)水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周CD44表達(dá)水平高于低劑量組(P<0.05)。說明接骨丸可明顯增加CD3表達(dá)水平，且呈劑量依賴性。見表4。

表1 各組大鼠血清鈣水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

表2 各組大鼠ALP水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

表3 各組大鼠CD3表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

表4 各組大鼠CD44表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

骨折主要是指骨的完整性及連續(xù)性失去，且包括局部軟組織和血管的損傷。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肢體損于外，則氣血傷于內(nèi)，致血脈離經(jīng)忘行，惡血留滯，形成血瘀，從而造成氣血運(yùn)行失常，瘀積不散，為腫為痛，故而應(yīng)以活血化瘀、消腫止痛、續(xù)筋接骨為主[8-10]。接骨丸主要成分為甜瓜子、土鱉蟲、地龍、桂枝(炒)、郁金、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、自然銅(煅醋淬)、馬錢子粉。其中甜瓜子具有消瘀散結(jié)功效，土鱉蟲具有破血逐瘀、續(xù)筋接骨功效，地龍具有清熱平肝、熄風(fēng)止痙、通絡(luò)除痹功效，桂枝具有溫通經(jīng)脈、散寒止痛功效，郁金具有活血行氣、疏肝利膽功效，骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛功效，續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎、續(xù)筋骨功效，自然銅具有散瘀止痛、截骨續(xù)筋功效，馬錢子粉具有溫絡(luò)止痛、散結(jié)消腫功效。縱觀全方，可奏血化瘀、消腫止痛、續(xù)筋接骨。故本研究應(yīng)用接骨丸治療SD骨折大鼠，取得了滿意的結(jié)果。

骨折愈合過程中，骨組織礦化是必須經(jīng)歷的過程，其中ALP參與細(xì)胞外基質(zhì)礦化過程，ALP切割有機(jī)磷酸酶，局部PO43-濃度增加，進(jìn)而結(jié)合鈣離子而啟動(dòng)鈣化過程，同時(shí)還可抑制ALP酶活性，在體內(nèi)和體外均會(huì)致使肢體骨骼礦化不良[11]。ALP主要分布在細(xì)胞的質(zhì)膜，并且在人體內(nèi)ALP存在于骨組織、腎和小腸黏膜，在骨組織中主要集中在骨化部位。血清鈣與蛋白結(jié)合，血中鈣、磷甲狀腺激素的調(diào)控下以及與骨組織中鈣、磷保持動(dòng)態(tài)平衡，骨折后骨折斷端的鈣鹽沉積，從而使血鈣濃度下降[12-13]。筆者本研究結(jié)果顯示，低劑量組和高劑量組治療4周血清鈣、ALP水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周血清鈣、ALP水平高于低劑量組。CD3和CD44作為細(xì)胞表面多功能黏附分子主要于各種類型的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，同時(shí)參與多種生理病理過程，其中包括腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合等。在骨組織中，CD3和CD44主要于破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用。有學(xué)者研究報(bào)道顯示，CD3和CD44在骨折骨痂軟骨細(xì)胞表達(dá)顯著減少[14]。筆者本研究結(jié)果顯示，低劑量組和高劑量組治療4周CD3、CD44水平高于對(duì)照組和模型組，且高劑量組治療4周CD3、CD44水平高于低劑量組。提示接骨丸可明顯增加CD3和CD44表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，接骨丸可能通過增加血清鈣、ALP、CD3、CD44表達(dá)水平，促進(jìn)骨折愈合。但本研究還存在一些不足之處，研究大鼠相對(duì)較少，研究作用機(jī)制方面相對(duì)較少，還需在后續(xù)研究工作中做深入實(shí)驗(yàn)研究，提供可靠的臨床參考價(jià)值。

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(2016-03-14收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Jiegu Pill on Expression of Serum Calcium, ALP, CD3, CD44 SD in Rats with Fracture

Jin Long1, Wang Xue2,Wang Bingqiang3

(1DepartmentofPharmacy,CangzhouPeople′sHospital,Cangzhou061001,China; 2DepartmentofBasicMedicine,CangzhouPeople′sHospital,Cangzhou061001,China; 3DepartmentofPharmacy,CangzhouMaternalandChildHealthCareHospital,Cangzhou061001,China)

Objective: To investigate the effect of Jiegu Pill on the expression of serum calcium, ALP, fracture CD3, CD44 in SD rats with fracture. Methods: Forty SD rats were randomly divided into four groups (control group, model group, low dose group, high dose group) with 10 rats in each group. Model group, low dose group and high dose group were given. Rats in the control group and the model group were given equal volume of ordinary saline and the low dose group was intragastricly administrated with Jiegu Pill solution of 0.4 g/kg concentration, while rats in the high dose group was intragastricly administrated with Jiegu Pill of 1.6 g/kg solution. Results: The serum calcium, ALP, CD3, CD44 levels of the model group, low dose group, high dose group a week and 2 weeks later after the treatment were lower than those in the control group. serum calcium, ALP, CD3, CD44 levels of the model group and the low dose group 3 weeks after the treatment were lower than those in the control group and the high dose group, but the levels of serum were higher in the high dose group compared to those of the control group 3 weeks after the treatment(P<0.05). The levels of serum calcium, ALP, CD3 and CD44 were higher in the high-dose group and low-dose group than those in the control group and the model group after 4 weeks treatment and the high-dose group was superior to the low-dose group (P<0.05). Conclusion: Jiegu Pill may increase the expression of serum calcium, ALP, CD3, CD44 and promote fracture healing.

Jiegu Pill; SD fracture rats; Serum calcium; ALP; CD3; CD44

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：131302066)——接骨丸中士的寧、馬錢子堿含量測(cè)定及肝腎毒性研究

金朗(1981.10—)，男，河北滄州人，藥學(xué)學(xué)士，主管藥師

王雪(1981.11—)，女，河北滄州人，碩士研究生，講師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:snowmiss@139.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.058