尿毒癥患者微炎狀態及FGF23的表達及其百令膠囊對其的影響

楊清柏 陳志忠 黃玉平 陳 紅 張慧敏

(解放軍第九五醫院,莆田,351100)

尿毒癥患者微炎狀態及FGF23的表達及其百令膠囊對其的影響

楊清柏 陳志忠 黃玉平 陳 紅 張慧敏

(解放軍第九五醫院,莆田,351100)

目的:觀察尿毒癥患者微炎狀態及FGF23的表達及百令膠囊對其的影響。方法:將本院100例尿毒癥患者納入研究,隨機分為對照組和觀察,同時將同期健康體檢50例設為健康組,觀察3組臨床生化指標、IL-6、FGF23水平的變化。結果:1)治療前尿毒癥患者平均動脈壓、BUN,SCr,EsR、血磷水平較健康對照組患者明顯升高(P<0.05),紅細胞、血紅蛋白及轉鐵蛋白明顯低于健康對照組(P<0.05)。而上述指標在2組尿毒癥患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。經過一階段治療后2組患者臨床生化指標均有不同程度的改善,其中使用百令膠囊的觀察組患者改善的幅度較對照組明顯,差異均有統計學意義(P<0.05)。2)2組患者治療前IL-6、FGF23均高于正常水平,治療后上述2種指標水平均有所下降,而其中百令膠囊組下降的趨勢更明顯。3)FGF23水平和IL-6濃度關系呈正相關性(r=0.242,P<0.01),FGF23與ALB及HDL水平均呈負相關關系(r1=-0.342,P1=0.01)及(r=-0.425,P<0.01)。結論:尿毒癥患者外周血清FGF和IL-6表達水平明顯上調;百令膠囊可能通過抑制IL-6表達改善尿毒癥透析患者炎性反應狀態;FGF23有可能成為尿毒癥透析患者炎性反應狀態早期診斷及干預的新靶點。

尿毒癥;微炎狀態;FGF23;百令膠囊

隨著腎功能進行性衰竭,尿毒癥機體逐漸發生一系列復雜的細胞水平的生物化學反應,同時其還屬于全身性的慢性微炎性反應,而此慢性微炎性反應狀態是以細胞因子驅動為特征，大量文獻研究證實電解質紊亂尤其是鈣磷代謝失衡可嚴重影響尿毒癥患者的生活質量,隨著研究的深入,我們得知成纖維細胞生長因子23(FGF23)作為新型的調磷因子與血磷代謝關系密切,一項多中心大樣本調查研究結果顯示FGF23水平上調可能是尿毒癥患者死亡的獨立危險因子[1-2],故我們認為如果某種干預手段可改變微炎狀態及降低FGF23水平,則可發揮治療尿毒癥的作用。長期的臨床觀察,我們發現百令膠囊可明顯改善尿毒癥患者的腎功能,因此我們設想:百令膠囊治療尿毒癥是否以炎性反應因子及FGF23進行橋接？為了證實這一觀點,我們對100例尿毒癥患者進行治療及觀察,現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2015年1月我院腎內科收治100例尿毒癥患者,所有入組患者診斷均符合2002年美國腎有關臟病學會(ASN)制定的腎臟病/透析臨床實踐指南(KDOQI)CKDS期標準。其中男57例,女43例,年齡49～62歲,平均年齡(53.4±1.2)歲。原發病:慢性腎炎29例,高血壓性腎病48例,糖尿病性腎病23例。所有患者腎小球濾過率均<15 mL/min。100例患者中非臥床腹膜透析67例,維持性血液透析33例。100例患者隨機分為對照組及觀察組各50例。2組患者在年齡、原發病等一般情況方面比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究得到本院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。

1.2 排除標準 1)3個月內使用過糖皮質激素或其他免疫抑制劑患者;2)合并嚴重心、腦、肝等重大臟器疾病或血液性疾病患者;3)自身免疫性腎損害患者;4)并發活動性結核、消化道出血、重度感染等。

1.3 治療方法 2組尿毒癥患者均采用常規血液灌流+血液透析,血液透析采用聚砜膜透析器,透析器膜面積為1.4～1.6 m2,透析液為碳酸氫鹽,使用的血液灌流器購自珠海健帆生物科技股份有限公司,血液灌流時血流量保持200～250 mL/min,血液灌流時長2 h,灌流后再進行常規透析2 h。觀察組在上述治療基礎上口服百令膠囊(杭州中美東華制藥有限公司生產,批號:C14000180754,規格:0.5 g/粒),3粒/次,3次/d。

1.4 血標本的采集及PBMC的分離及培養

1.4.1 主要試劑與儀器 RPMI 1640和胎牛血清(美國Gibco公司);人淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)。CRP ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);兔來源FGF23抗體(美國CST公司)。

1.4.2 生化指標檢測 所有入組患者均檢測血壓,查血常規、膽固醇、TG、BUN、SCr、ESR、血清鐵、鐵轉蛋白、CRP。囑患者抽血前一天晚上10點始禁食,次日清晨空腹抽取肘靜脈血10 mL,置于血清管中,30 min內在4 ℃條件下以1 000 g轉速離心10 min,吸取上清液置于-80 ℃冰箱中備用。所有指標采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA),應用全自動生化分析儀(日立7180型)取待測血液,根據購自上海谷研實業有限公司ELISA試劑盒說明進行操作。

1.4.3 PBMC的分離與培養 將采集的外周血3 mL置于肝素管內,用于PBMC的分離,用人淋巴細胞分離液提取外周血單核細胞(PBMC,1×106/mL)200 μL,置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中,加入刺激劑佛波醇乙酯(PMA)及離子霉素、莫能霉素等工作液并混勻,置于37 ℃,5% CO2。培養箱中培養4～6 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,離心收集細胞。

1.4.4 Western blotting檢測FGF23濃度 收集上述步驟提取的單核細胞,然后加入細胞裂解液,充分裂解后置于4 ℃ 12 000 r/min離心機離心10 min。取上清液獲取總蛋白,再根據DAB方法對所提蛋白液進行濃度測定,之后以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性,接著可按照每泳道上樣量為50 μg蛋白,計算上樣量,電泳(4%濃縮膠,12%分離膠,120 V,50 mA,1.5 h)結束后將凝膠取出,用PVDF膜轉印,遵循膠在負極,膜在正極的原則,50 V,100 mA,2 h,5%脫脂奶粉液的封閉2 h,TBS洗3次,5 min/次,分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗FGF23和β-actin抗體(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,TBS洗3次,5 min/次,加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫2 h,TBS洗3次,5 min/次。將濾膜放人配好的顯色液中顯色15～30 min,計算機掃描圖像,并由生物圖像分析系統(Bio-Rad公司,Model Gel Doc 2000,美國)分析處理。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0分析軟件進行統計學處理,計量資料以(均數±標準差)表示,組間比較當方差齊時采用方差分析或t檢驗,不齊采用秩和檢驗;組內用配對t檢驗進行組間分析。計數資料采用非參數卡方等檢驗。相關性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者臨床生化指標的比較 治療前尿毒癥患者平均動脈壓、BUN,SCr,EsR、血磷水平較健康對照組患者明顯升高(P<0.05),紅細胞、血紅蛋白及轉鐵蛋白明顯低于健康對照組(P<0.05)。而上述指標在2組尿毒癥患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。經過一階段治療后2組患者臨床生化指標均有不同程度的改善,其中使用百令膠囊的觀察組患者改善的幅度較對照組明顯,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、表2。

2.2 百令膠囊可改善尿毒癥患者的微炎狀態 2組尿毒癥患者外周血IL-6水平明顯高于健康對照組(P<0.05),2組尿毒癥患者之間差異無統計學意義(P>0.05),治療后發現百令膠囊可更明顯降低尿毒癥患者IL-6水平(P<0.05)。見圖1。

圖1 2組治療前后IL-6濃度的變化

2.3 百令膠囊可明顯清除尿毒癥患者FGF23水平

2組尿毒癥患者外周血FGF23水平明顯高于健康對照組(P<0.05),FGF232組尿毒癥患者之間差異無統計學意義(P>0.05),治療后發現百令膠囊可更明顯清除尿毒癥患者FGF23水平(P<0.05)。見表3。

2.4 FGF23及其他生化指標的相關分析 FGF23水平和IL-6濃度關系呈正相關性(r=0.242,P<0.01),FGF23與ALB及HDL水平均呈負相關關系(r1=-0.342,P1=0.01)及(r=-0.425,P<0.01)。見圖2～4。

表1 3組生化指標指標的比較±s)

注:與健康對照組比較*P<0.05,組間比較差異無統計學意義P>0.05。

表2 2組尿毒癥患者治療前后生化指標變化±s)

注:與治療前比較*P<0.05,與對照組比較△P<0.05。

表3 2組尿毒癥患者治療前后FGF23灰度值變化

注:與治療前比較*P<0.05,與對照組比較△P<0.05。

3 討論

尿毒癥嚴重威脅人類生命安全,感染、代謝綜合征、貧血等嚴重并發癥是尿毒癥死亡的重要因素。有數據顯示約有90%終末期腎病患者同時合并系統性炎性反應,從而增加了慢性腎病患者感染的風險,造成不良預后。微炎程度目前已被視為評估終末期腎病的有力指標,臨床上尿毒癥患者在規律透析幫助下可排除體內大量毒素,但是仍有大量的中小分子毒素累積于機體內,導致機體內環境紊亂,腎素-血管緊張素系統在毒素的刺激下被激活[3-5],另一方面,晚期糖基化終產物不斷刺激單核細胞,使之釋放了大量的炎性反應遞質,從而進一步加劇機體炎性反應,因此“微炎狀態學說”已然成為評估尿毒素患者的疾病的手段,在此基礎及時干預將是改善患者預后的重要策略[6-7]。本研究對100例尿毒癥患者進行治療觀察,結果顯示尿毒癥患者大部分生化指標均較健康體檢者明顯改變,而此種改變在經過規律透析后可一定程度就糾正,其中使用百令膠囊的觀察組患者改善的趨勢較對照組明顯,因此我們有理由相信百令膠囊對尿毒癥有理想療效。

圖2 IL-6與FGF23相關性分析

圖3 ALB與FGF23相關性分析

圖4 HDL與FGF23相關性分析

尿毒癥屬于中醫“癃閉”“關格”等范疇,在尿毒癥的臨床表現中可見嘔吐、水腫、少尿、面黃、頭暈、氣促、失眠、便秘等,與古代文獻中“關格”極為相似。《證治匯補·癃閉附關格篇》一書中描述:“既關且格,必小便不通,旦夕之間,陡增嘔惡,此因濁邪壅塞三焦,不得升降。所以關應下而便閉,格應上而生嘔吐,陰陽閉絕,一旦即死,最為危候”。從大量臨床文獻研究中我們發現肺腎兩虛是尿毒癥最常見的證型,因此益肺補腎是治療尿毒癥的主要治療原則。冬蟲夏草是我國廣泛運用的中藥,其性味甘平,可保肺腎,補精髓,對于肺腎兩虛及精血不足的病癥有理想的治療作用。而百令膠囊是由冬蟲夏草菌種經低溫發酵制成,因此百令膠囊具有明顯補肺腎,益精氣之功效[8-13],在本研究中我們發現百令膠囊可明顯改善尿毒癥患者的病情,在進一步觀察中我們發現尿毒癥患者血清中IL-6濃度明顯高于健康者,這也證實了尿毒癥患者處于明顯的炎性狀態,而這種狀態在患者接受百令膠囊中可在一定程度上被糾正,這說明百令膠囊可明顯改變尿毒癥患者的微炎狀態。

本研究首次觀察了尿毒癥患者外周血單核細胞FGF23的濃度變化,并將其與IL-6、ALB及HDL水平進行相關性分析,結果顯示FGF23與IL-6具有正相關關系,IL-6是公認的炎性反應因子,因此我們相信FGF23可能也參與了尿毒癥患者炎性反應的病理環節,而這一過程可能通過IL-6介導完成。研究中我們還發現尿毒癥患者FGF23的表達水平與ALB及HDL呈負相關性,因此FGF23與不良臨床生化指標亦有緊密的聯系,其可能成為衡量尿毒癥患者炎性狀態及內環境紊亂的穩定性生物學標志物,百令膠囊可顯著降低尿毒癥患者的FGF濃度,從而達到治療的目的。血磷代謝紊亂是慢性腎病患者死亡的獨立危險因子,終末期腎病患者腎臟排磷功能嚴重受損,此外患者飲食中攝入部分磷,導致血磷的潴留。另一方面,血磷屬于機體小分子毒素,尿毒癥患者透析時血磷以分子擴散的形式越過透析膜向透析液一側移動,不易排出體外,從而引起高磷血癥,增加了死亡的風險。FGF23是有氨基酸組成的信號肽,由骨細胞分泌,腎臟是其靶器官,有明顯的抑制磷重吸收的作用,是重要的調磷因子。生理狀態下,血磷濃度的上調可刺激FGF23分泌,而尿毒癥患者腎功能持續性下降,盡管血磷潴留明顯,但FGF23已失去調磷作用,故無法緩解此種狀態。研究中我們發現尿毒癥患者血磷濃度的確高于健康組,而百令膠囊可在一定程度降低尿毒癥患者的血磷水平,故我們認為通過抑制FGF23的分泌可調節尿毒癥患者血磷狀態,從而達到治療的目的。

[1]ShavitL,Mikeladze I,Torero C,et al.Mild hyponatremiais associated with functional and cognitived ecline in chronic hemodialysispatients[J].Clin Nephrol,2014,82(5):313-319.

[2]危正南,張慶紅,吳東,等.高通量血液透析對尿毒癥患者血漿毒素分子含量及機體微炎癥狀態的影響[J].海南醫學院學報,2016,22(6):558-561.

[3]Holdsworth SR,Summers SA.MicroRNA-155 a new therapeutic target in crescentic GN[J].J Am Soc Nephrol,2013,24(12):1927-1929.

[4]Go AS,Chertow GM,Fan D,et al.Chronic kidney disease and the risks of death,cardiovascular events,and hospitalization[J].N Engl J Med,2004,351(13):1296-1305.

[5]Zhang L,Wang F,Wang L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:a cross-sectional survey[J].Lancet,2012,379(9818):815-822.

[6]Shan Y,Zhang Q,Liu Z,et al.Prevalence and risk factors associated with chronic kidney disease in adults over 40 years:a population study from Central China[J].Nephrology(Carlton),2010,15(3):354-361.

[7]Carrero JJ,Stenvinkel P.Inflammation in end-stage renal disease——what have we learned in 10 years?[J].Semin Dial,2010,23(5):498-509.

[8]陸曉東.百令膠囊治療慢性腎衰的動物實驗研究[J].實用中醫內科雜志,2004,18(6):507-508.

[9]郭彥豐,高偉,韓新英.中西醫結合治療慢性腎衰34例臨床觀察[J].國醫論壇,2004,19(4):41.

[10]程威英,是俊風,蔣更加.百令膠囊對慢性腎功能衰竭患者蛋白質代謝的影響[J].上海中醫藥雜志,2009,10(7):39.

[11]何小玲,逯寧,劉彤,等.雷帕霉素和中藥百令膠囊是大鼠小腸移植后細胞凋亡和FasL mRNA表達作用[J].中國中西醫結合外科雜志,2001,7(2):102-105.

[12]劉春麗.尿毒癥的中醫辨證論治[J].中國中醫藥現代遠程教育,2011,9(13):112-114.

[13]李陽,陳晨.從脾腎論治慢性腎功能不全60例[J].中醫藥臨床雜志,2010,22(10):875.

(2016-09-26收稿 責任編輯：王明)

Mild Inflammation Status, Expression of FGF23 in Patients with Uremia and Bailing capsule′s impact on it

Yang Qingbo,Chen Zhizhong,Huang Yuping,Chen Hong,Zhang Huimin

(The95thHospitalofChinesePeople,sLiberationArmy,Putian351100,China)

Objective:To observe the mild inflammation status and the expression of FGF23 in patients with uremia and Bailing capsule′s impact on it.Methods:Totally 100 cases of patients with uremia in our hospital were included into the study, randomly divided into the control group and the observation group. And 50 cases of healthy check-up in the same period were the healthy group. The clinical biochemical index, CRP, FGF23 levels changes of the three groups were observed. Results:1) Before the treatment, mean arterial pressure, BUN, SCr and EsR levels of the uremic patients increased significantly comparing to the healthy and control groups (P<0.05), erythrocyte, hemoglobin and transferrin significantly lower than healthy and controls groups (P<0.05). And the above indexes were with no statistically significant difference between the two groups of patients with uremia (P>0.05). After a period of treatment, the clinical biochemical indicators of patients in the two groups had different degrees of improvement. The observation group, which took Bailing capsules, had more obvious improvement than the control group, and the differences were statistically significant (P<0.05); 2) The IL-6 and FGF23 level of both groups before treatment were higher than normal levels, and both of the 2 levels decreased after treatment, but the downward trend of Bailing capsule group was more obvious. 3) The relationship between the concentration of FGF23 and IL-6 levels had positive correlation (r=0.242,P<0.01). FGF23 and ALB and HDL levels had negative correlation (r1=-0.342P<0.01) and (r=-0.425,P<0.01) .Conclusion:The expression level of peripheral blood FGF and IL-6 in patients with uremia increased obviously; Bailing capsule may inhibit the expression of IL-6 to improve the status of inflammation in patients with uremia hemodialysis; FGF23 may become a new target for early diagnosis and intervention of inflammation in patients with uremia hemodialysis.

Uremia； Mild inflammation status； FGF23； Bailing capsule

國家自然科學基金青年項目(編號:30600795)

楊清柏(1986.01—),男,本科,住院醫師,研究方向:腎臟疾病的治療,E-mail:330347999@qq.com

R256.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.039