銀杏葉提取物對阿爾茨海默病患者認知功能的效果及其對相關因子的影響

黃建申 沈英生 黃金武

(南京軍區福州總醫院第一附屬醫院，莆田，351100)

銀杏葉提取物對阿爾茨海默病患者認知功能的效果及其對相關因子的影響

黃建申 沈英生 黃金武

(南京軍區福州總醫院第一附屬醫院，莆田，351100)

目的：觀察銀杏葉提取物對阿爾茨海默病患者認知功能的改善效果以及探討其部分作用機制。方法：將本院2013年1月至2014年1月收治的80例阿爾茨海默病患者隨機分為對照組和觀察組各40例。2組患者均口服鹽酸多奈哌齊，1次/d，10 mg/次。在此基礎上觀察組患者加用銀杏葉提取物注射液，2組均連續治療3個月，分別比較2組患者治療前、治療1個月及治療3個月后簡易精神狀態量表(MMSE)、畫鐘試驗積分(CDT)、日常生活能力積分(ADL)的變化，以及檢測2組患者治療前后外周血清cAMP-PKA-CREB信號通路上標志性蛋白cAMP、PKA及CREB濃度的變化。結果：1)2組患者治療前MMSE、CDT及ADL的積分差異無統計學意義(P>0.05)，治療1個月后2組患者MMSE、CDT及ADL積分較治療前有所提升(P<0.05)，組間差異無統計學意義(P>0.05)；治療3個月后2組患者MMSE、CDT及ADL積分進一步改善，其中觀察組改善的幅度明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。2)使用Elisa法檢測cAMP、PKA濃度，用Western blotting檢測CREB濃度，治療前2組患者cAMP、PKA、CREB蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)，治療3個月后觀察組患者外周血清cAMP、PKA、CREB蛋白濃度均明顯高于對照組(P<0.05)。結論：銀杏葉提取物可改善阿爾茨海默病患者認知能力，其作用機制可能通過介導cAMP-PKA-CREB信號通路有關。

阿爾茨海默病；認知功能；銀杏葉提取物；cAMP-PKA-CREB信號通路

阿爾茨海默病是一種原因不明的進行性神經退行性疾病，其導致患者對外界的感知能力遲鈍甚至錯亂，嚴重影響患者日常生活能力，所產生的傷害遠大于器質性損傷[1-2]。根據最新流行病學調查研究顯示，全球約有1 000萬阿爾茨海默病患者，年齡每增加5歲，患病率將增加2倍。因此改善阿爾茨海默病患者認知能力是目前臨床刻不容緩的任務。

阿爾茨海默病屬于中醫學“呆病”“善忘”等范疇，近年來我們對國內外大量文獻進行查閱，發現瘀血阻絡是阿爾茨海默病患者的主要病機類型，因此我們認為活血化瘀是阿爾茨海默病患者的主要治則。銀杏葉提取物注射液具有明顯活血化瘀功能，可改善各類認知功能障礙，這一結果被諸多文獻所證實，但其改善認知功能的作用機制尚未明了。近年來研究顯示cAMP-PKA-CREB信號通路其通過參與管理神經元細胞的增殖凋亡，從而與神經系統的學習和記憶能力關系密切，因此我們設想：銀杏葉提取物改善阿爾茨海默病患者認知功能是否通過cAMP-PKA-CREB信號通路進行橋接？因此本團隊進行一系列臨床觀察研究，為目前熱門的臨床診療提供切實可行的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2014年1月至2015年1月收治的80例阿爾茨海默病患者納入研究，所有入組患者均符合2001年中華醫學精神科分會頒布的《中國精神障礙分類和診斷標準》中關于阿爾茨海默病的相關診斷標準[3]。80例患者隨機分為對照組和觀察組各40例，2組患者在年齡、性別、病程等一般情況方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 納入標準 1)年齡≥60歲；2)患者有記憶力減退、注意力不集中、行為紊亂、睡眠障礙等癥狀；3)近30 d未服用改善認知藥物；4)患者或家屬簽署知情同意書。

1.3 排除標準 1)年齡<60歲；2)有肝腎等重大臟器病變或合并腫瘤；3)全身性疾病等其他引發癡呆；4)患者或家屬不予前述知情同意書者。

1.4 治療方法 2組患者均口服鹽酸多奈哌齊(安理申，衛材(中國)藥業有限公司，國藥準字H20050978)，1次/d，10 mg/次，觀察組在此基礎上加用銀杏葉提取物注射液(金納多，臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司，國藥準字HC20140019，5 mL/支)，5 mL銀杏葉提取物注射液+250 mL 0.9%氯化鈉溶液，靜脈滴注，1次/d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 簡易精神狀態量表(MMSE)量表評分[11]該量表包括時間、空間定向力、遲記憶力、注意力及計算力，語言表達力等，總分為30分，<23分為認知功能缺陷。

1.5.2 畫鐘試驗 要求患者在白紙上獨立畫出一個鐘，并標出指定的8:25或9:10的位置，并且要求患者在10 min內完成。畫鐘試驗積分(CDT)規定如下：畫出閉鎖圓圈得1分；將數字安放在表盤上正確位置得1分；表盤數字順序正確得1分；指針位置安放正確得1分。

1.5.3 日常生活能力評分 日常生活能力積分(ADL)共有14項，包括2部分內容：1)軀體生活自理量表，共6項：如側、進食、穿衣、梳洗、行走和洗澡；2)工具性日常生活能力量表，共8項：打電話、購物、備餐、做家務、洗衣、使用交通工具、服藥和自理經濟。

1.5.4 ELISA檢測cAMP、PKA表達水平 1)采取患者肘靜脈血4 mL，制備血清標本，充分分解，然后加樣、稀釋標本置于反應孔、加入待測樣品，再加入IL-8抗體；2)溫育洗滌后加入親和鏈酶素-HRP，混勻溫育30 min；3)洗滌4次后每孔加入底物A、B各50 μL混勻，37 ℃溫育10 min，避免光照；4)取出酶標板，立即加入50 μL終止液測定結果。

1.5.5 Western blotting檢測CREB濃度 將外周血加入淋巴細胞分離液提取外周血單核細胞，利用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基將提取的細胞置于置于37 ℃，5%CO2環境中培養4～6 h，隨后以3 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集細胞，然后加入細胞裂解液，充分裂解后置于4 ℃，12 000 r/min離心機離心10 min。取上清液獲取總蛋白，再根據DAB方法對所提蛋白液進行濃度測定，之后以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性，接著可按照每泳道上樣量為50 μg蛋白，計算上樣量，電泳(4%濃縮膠，12%分離膠，120 V，50 mA，1.5 h)結束后將凝膠取出，用PVDF膜轉印，遵循膠在負極，膜在正極的原則，50 V，100 mA，2 h，5%脫脂奶粉液的封閉2 h，TBS洗3次，每次5 min，分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗CREB和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBS洗3次，每次5 min，加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫2 h，TBS洗3次，每次5 min。將濾膜放人配好的顯色液中顯色15～30 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統Bio-Rad公司,Model Gel Doc 2000,美國)，分析處理。

2 結果

2.1 銀杏葉提取物注射液可提高患者的認知能力及日常生活能力 2組患者治療前MMSE、CDT及ADL的積分差異無統計學意義(P>0.05)，治療1個月后2組患者MMSE、CDT及ADL積分較治療前有所提升(P<0.05)，但組間差異無統計學意義(P>0.05)；治療3個月后2組患者MMSE、CDT及ADL積分進一步改善，其中觀察組改善的幅度明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組患者一般資料比較

表2 2組MMSE評分比較，分)

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時期對照組比較P<0.05；▲表示與同組治療后1個月比較P<0.05。

表3 2組CDT評分比較，分)

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時期對照組比較P<0.05；▲表示與同組治療后1個月比較P<0.05。

表4 2組ADL評分比較，分)

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時期對照組比較P<0.05；▲表示與同組治療后1個月比較P<0.05。

2.2 銀杏葉提取物注射液可提高阿爾茨海默病患者外周血cAMP、PKA、CREB的濃度 使用Elisa法檢測cAMP、PKA濃度，用Western blotting檢測CREB濃度，治療前2組患者cAMP、PKA、CREB蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)，治療3個月后觀察組患者外周血清cAMP、PKA、CREB蛋白濃度均明顯高于對照組(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 2組治療前后cAMP及PKA濃度比較

注：*表示與治療前比較P<0.05;△表示與同時期對照組比較P<0.05。

圖1 2組治療前后CREB蛋白結果比較

3 討論

在我國經濟水平不斷發展的同時人口老齡化亦日趨嚴重，年齡的不斷增長致使機體自身功能水平不斷下降，增加了患病的風險。現代醫學認為阿爾茨海默病的發生與腦組織彌漫性萎縮性改變從而導致老年患者出現智能障礙[4-6]。目前醫學仍將阿爾茨海默病界定為無法痊愈的疾病，患者雖然接受改善腦循環、營養腦神經等治療，但臨床效果抑制差強人意[7-9]。近年來中草藥以療效顯著、安全性高等特點被諸多臨床工作者所認可。在多年的臨床工作中我們發現銀杏葉提取物注射液對改善認知功能障礙患者的認知能力方面有明顯的效果，隨著阿爾茨海默病患者發病率的逐年增加，我們對銀杏葉提取物注射液治療阿爾茨海默病患者的療效進行了觀察總結，結果顯示銀杏葉提取物注射液可明顯提高阿爾茨海默病患者的MMSE、CDT及ADL評分，這說明該藥物可改善認知能力，從而提高患者的日常生活能力，在研究中我們發現，治療1個月時2組患者組間認知能力及日常生活能力相仿，直至治療3個月后組間上述指標差異才具有統計學意義，因此我們認為銀杏葉提取物注射液的確可明顯改善阿爾茨海默病患者的認知能力，但其具有一定的時間和劑量依賴性。

阿爾茨海默病屬于中醫學“呆病”“善忘”等范疇，《醫學震中參西錄》中提到：“腦髓純者靈，雜者鈍”，故本病病位在腦。唐容川在《中西匯通醫書種》一書中寫到：“血在上，則濁蔽而不明矣，凡有瘀者，亦令健忘”。且在查閱大量臨床文獻及隨訪大量臨床患者，我們亦認為瘀血阻滯是阿爾茨海默病的主要證型，機體十二經脈，三百余絡，其血皆上于面而走空竅，此空竅即腦髓，故氣血通順濡養腦竅是發揮理想技能的基礎。老年患者氣血虧虛致瘀，清代王清任在《醫林改錯》一書中寫到“氣血凝滯，腦氣與臟腑不通，如夢，如呆”，因此，氣虛血滯，氣血無法上注于清竅，腦髓失養，病程日久者出現善忘、癡呆等智能減退癥狀，因此，活血化瘀是調和血脈，清竅得養的關鍵[10-13]。銀杏葉是傳統的活血化瘀藥，傳統藥理學認為銀杏葉提取物注射液可選擇性擴張腦血管，從而增加腦組織血氧含量，改善患者血液流變學，從而改善循環，最終實現改善腦功能的目的，但是隨著臨床研究的不斷深入，我們在臨床上發現，有部分阿爾茨海默病患者使用銀杏葉提取物注射液治療后認知功能有明顯的提升，但其血液流變學與治療前相比并無明顯變化，因此，我們認為銀杏葉提取物注射液介導阿爾茨海默病患者的功能改善機制可能存在多靶點。

現代醫學[14-15]對認知能力研究逐漸發展至分子生物學水平，研究人員逐漸發現cAMP-PKA-CREB信號通路與認知功能具有密切關系，通過解剖實驗大鼠發現cAMP-PKA-CREB信號通路的標志性蛋白在海馬組織有廣泛的分布，而海馬是與記憶關系密切的腦組織結構。cAMP是細胞轉導的第二信使，將激素或神經遞質轉導致靶細胞后通過磷酸化靶酶，從而參與基因的開啟表達、細胞的增殖、代謝及凋亡。PKA是神經元細胞重塑的主要物質，具有催化活性作用的PKA在保持長時程記憶環節有重要作用。使細胞膜上G蛋白的偶聯受體與細胞內的配體相結合而活化，從而使cAMP濃度增加，活性及濃度增強的cAMP與具有催化活性的PKA相結合，出現核移位而進入細胞核內磷酸化下游重要因子CREB，從而開啟了下游靶基因的轉錄。CREB是機體多條重要信號通路的共同作用點，對記憶、學習以及各類情緒變化均具有重要的維持及調節作用。諸多動物研究顯示抑制大鼠海馬cAMP-PKA-CREB的表達，大鼠的記憶力出現明顯下降。在本研究中我們對2組患者治療前后外周血清的cAMP-PKA-CREB信號通路的標志性蛋白進行檢測，結果顯示2組患者經過治療干預后cAMP、PKA、CREB蛋白的濃度均出現上調，其中觀察組上調的幅度較對照組明顯，這一結果提示銀杏葉提取物注射液可改善阿爾茨海默病患者認知功能的作用機制可能與提高cAMP-PKA-CREB信號通路的標志性蛋白表達水平有關。

總之，杏葉提取物注射液治療阿爾茨海默病患者具有明顯的醫療價值，其作用機制可能與介導cAMP-PKA-CREB信號通路的標志性蛋白表達水平有關。

[1]范麗偉.丙戊酸鎂緩釋片聯合鹽酸多奈哌齊膠囊治療老年癡呆精神行為障礙的療效觀察[J].內科急危重癥雜志,2014,20(1):34-35.

[2]張玉琦,徐文煒,程灶火,等.奧氮平或喹硫平聯合多奈哌齊治療老年癡呆精神行為癥狀的療效和安全性研究[J].中國醫藥導報,2012,9(26):73-75.

[3]中華醫學精神科分會.中國精神障礙分類與診斷標準(CC—MD3)[M].3版.濟南:山東科學技術出版社,2001:33-39.

[4]劉艷,趙曉玲,王蕾,等.多奈哌齊與尼莫地平聯合治療老年期血管性癡呆的臨床觀察[J].中華老年心腦血管病雜志,2010,12(6):488-490.

[5]段曉宇,張正春,蔡秀英,等.尼莫地平對阿爾茨海默病大鼠認知功能的影響[J].蘇州大學學報:醫學版,2012,32(5):645-648.

[6]王霞,梁卓燕,李慧芳,等.鹽酸多奈哌齊聯合尼莫地平治療血管性癡呆的臨床觀察[J].臨床薈萃,2012,27(6):482-484.

[7]余慶.記憶能力及海馬神經元凋亡的影響[J].四川醫學,2009,30(12):1861-1865.

[8]王里.鹽酸多奈哌齊聯合用藥方案延緩老年癡呆患者病情進展的作用[J].中國老年學雜志，2014,34(20):5849-5850.

[9]楊紅,朱德生.鹽酸多奈哌齊治療老年癡呆的療效研究[J].中國全科醫學,2013,16(8):853-856.

[10]邱幸凡,袁德培,王平,等.腎虛髓衰、腦絡痹阻是老年性癡呆的基本病機[J].河南中醫學院學報,2006,21(2):11-13.

[11]時晶,魏明清,馬福云,等.血管性認知損害的中醫證候特征[J].中醫雜志,2012,53(6):503-506.

[12]健芬,覃翠,楊波.腎虛血瘀論治阿爾茨海默病的探討[J].光明中醫,2010,25(1):58-59.

[13]梁紀文,黃淑芳.老年性癡呆的中醫辨證及中成藥應用[J].中國臨床醫生,2010,38(8):19-21.

[14]李曉恒,劉能保,張敏海,等.慢性復合應激性學習記憶增強大鼠海馬神經細胞增殖和突觸后Fyn表達的變化[J].解剖學報,2005,36(6):591-596.

[15]Jagasia R,Steib K,Englberger E,et al.GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus[J].JNeurosci,2009,29(25):7966-7977.

(2016-09-13收稿 責任編輯：張文婷)

Effect of Ginkgo biloba extract on Cognitive Function of Senile Dementia Patients and Its Effect on Related Factors

Huang Jianshen,Shen Yingwu,Huang Jinwu

(FuzhouGeneralHospitalFirstAffiliatedHospitalofNanjingMilitaryRegion,Putian351100,China)

Objective:To observe the improvement effect of the ginkgo biloba extract on the cognitive function in the patients with senile dementia, and discuse its mechanism. Methods:A total of 80 senile dementia patients in our hospital during in January 2013-January 2014 were randomly divided into control group and observation group, 40 cases in each group. Both of the two groups orally took Donepezil HCL, once a day, 10 mg/time. The observation group additionally had ginkgo biloba extract injection on these basis, both two group had continuous treatment for 3 months and then compare the two groups′mini-mental state examination(MMSE), clock drawing task (CDT), activity of daily living (ADL) before treatment, and 1 month and 3 months after treatment, as well as detect two groups′concentration changes of iconic proteins cAMP, PKA and CREB in patients with peripheral serum cAMP-PKA-CREB signaling pathways before and after treatment. Results:1) Integral differences of MMSE, CDT and ADL were showed no statistical significance in the two groups after the treatment (P>0.05), the MMSE, CDT and ADL integral rose after 1 month′s treatment in the two groups (P<0.05), but there was no statistically significant differences between the two groups (P>0.05); and 3 months after treatment, MMSE, CDT, ADL integral of the two groups further improved, which the improvement extent of observation group was significantly higher than the control group, the differences were statistically significant (P<0.05). 2)The cAMP, PKA concentration detected by Elisa method, and CREB concentration by Western blotting test showed no statistically significant differences between the two groups (P>0.05), but 3 months after treatment, cAMP, PKA, and CREB protein concentrations in peripheral blood in the treatment group were significantly higher than that of control group (P<0.05). Conclusion:Ginkgo biloba extract can improve the cognitive ability in patients with senile dementia, the mechanism may be related to cAMP-PKA-CREB signaling pathways.

Senile dementia; Cognitive function; Ginkgo biloba extract; cAMP-PKA-CREB signaling pathways

國家自然科學基金青年項目(編號：30600795)

黃建申(1982.09—)，男，大學本科，醫師，研究方向：腦血管疾病，E-mail：178419573@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.028