表達hCD4和hCCR5基因的慢病毒載體的構建

李雅婧　諸葛福艷　梁娟　何金洋　譚寧　曾常春

摘要：目的：構建一種高效轉染hCD4和hCCR5基因的慢病毒載體。方法：應用Gateway技術構建可表達hCD4和hCCR5的質粒載體PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5，并進行酶切和測序鑒定，進行慢病毒包裝，用qRT-PCR方法檢測293T細胞中hCD4/CCR5的mRNA表達。將本慢病毒載體轉染于小鼠白血病細胞L615，應用qRT-PCR檢測細胞內hCD4/CCR5 mRNA的表達及對HIV-1的易感性。結果：成功構建PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5質粒表達載體，包裝成的慢病毒載體在293T細胞中具有hCD4/CCR5 mRNA水平的高表達（P<0.05）；轉染于L615細胞亦表現出hCD4/CCR5 mRNA水平的高表達（P<0.05），并具備了HIV-1入胞感染的特點。結論：成功建立hCD4和hCCR5基因雙啟動的慢病毒載體，可使目的細胞高效表達hCD4及hCCR5分子，對HIV-1宿主細胞的制備、HIV/AIDS的發病機制和抗病毒研究具有積極的意義。

關鍵詞：慢病毒載體；hCD4/hCCR5；質粒；基因表達

中圖分類號：R318 文獻標志碼：A 文章編號：1008-2409（2016）05-0006-06

慢病毒是一類逆轉錄病毒，包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猿免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）和貓免疫缺陷病毒（feline immunode ficiency virus，FIV）等。慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到長期穩定表達。作為一種體外基因運輸的工具，與其他逆轉錄病毒相比，慢病毒不但能感染分裂細胞，而且還能感染非分裂細胞，已發展為轉基因動物和基因治療研究的重要工具。hCD4分子是一種膜分子，主要表達于輔助T（Th）細胞，也是HIV-1入侵細胞的主要受體。hCCR5作為G蛋白偶聯因子超家族（GPCR）成員的細胞膜蛋白，是細胞內β趨化因子（RANTES、MIP-lα和MIP-1β）的受體，亦是HIV-1入侵機體細胞的主要輔助受體之一。本實驗通過構建hCD4/CCR5基因慢病毒載體，為新的HIV-1宿主細胞研制提供基本條件。

1材料與方法

1.1材料

GatewaySPCIonase^TMⅡEnzymeMix、GatewayLRClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix購自invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司，質粒小提試劑盒購自TIANGEN公司，PrimeSTAR^TMHSDNA Polymeras、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、GeneRuler^TM100 bp DNA Ladder購自Takara公司，細胞培養基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰酶購自GIBCO公司，包裝質?；旌衔铮╒iraPower^TMPackaging Mix）由pHelper1.0、pHelper2.0、LV3/LV5 3個質粒成比例混合而成，購自美國Invitrogen公司慢病毒轉染試劑盒，轉染混合液：Opti-MEM I、Lipofeetamine 2000購自invitrogen公司，RNA提取試劑購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自Takara公司。

1.2制備方法

1.2.1利用PCR擴增attBl-CD4-attB2反應體系為5×Primer STARTM Buffer（Mg²⁺Plus）10μl，dNTPMixture（10μm）4μl，引物-F（10 μm）1μl，引物-R（10 μm）1μl，模板DNA 1μl，Primer STARTM HSDNA Polymerase 0.5μl，ddH20加至總體積50μl。擴增程序：98℃3 min，98℃10 s，60℃10 s，72℃60 s共30個循環，72℃5 min；最后6×loading buffer終止反應。用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收參照QIAquick的瓊脂糖凝膠電-泳回收試劑盒，20℃冰箱保存。

1.2.2構建pDown-CD4，pUP-Promoter、pTail-IRES/CCR5 25℃，BP反應3 h（反應體系為attB₁-CD4-attB₂100ng，pDonr221/pDonrP4P1r/pDonrP2rP3100ng，BP clonase 1μl，TE buffer up to 5μl）；加入蛋白酶K終止反應（10 min，37℃）；轉化BP反應產物到大腸桿菌Stb13；菌落PCR篩選陽性克?。≒CR反應體系：10×Taq Buffer with（NH₄）₂SO₄3μl，dNTP Mixture（10μm）3μl，MgCl₂2μl，引物-F（10μm）1.2μl，引物-R（10μl）1.2 μl，TaqDNApolymerase 1.5μl，模板DNA 2μl，ddH₂O 16.1μl，總體積為30μl。PCR擴增程序：94℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1min共29個循環，72℃1 min；挑取陽性克隆質粒；送交陽性克隆測序。

1.2.3構建重組病毒質粒PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5小量提取質粒pDown-CD4和骨架載體，25℃，LR反應3 h；反應體系為pUP-CMV12.89 ng，pDown-CD4 10.42 ng，pTail-IRES/CCR513.03 ng，骨架載體60.28 ng，LR clonase 1μl，TEbuffer up to 5μl；加入蛋白酶K終止反應10 min；轉化LR反應產物到Stbl3；菌落PCR篩選陽性克隆；挑取陽性克隆質粒；送交陽性克隆測序。

1.2.4基于293T細胞的慢病毒包裝 在5ml離心管先加入1-5 ml無血清Opti-MEMI培養液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的質粒（各4μg），輕輕顛倒混勻；另取1支無菌的5 ml離心管，加入1.5ml無血清Opti-MEMI培養液和40μl的Lipofeetamine 2000，輕輕顛倒混勻。室溫孵育5min；將已稀釋DNA加入到含有Lipofeetamine 2000的無血清Opti-MEM I培養液中，輕輕顛倒混勻。室溫孵育20min，制備獲得DNA-Lipofeetamine 2000復合物。將復合物添加到293FT細胞中過夜培養，轉染后24h，更換10 ml含10%血清DMEM培養液。轉染后48 h、72 h收集培養上清進行濃縮，分裝好的病毒放置80℃保存。

1.2.5 293T細胞中mRNA的qRT-PCR檢測 取對數生長期的293T細胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO₂的培養箱中培養。當細胞融合率達50%左右，加入慢病毒載體，傳代培養。7 d后收集細胞用Trizol法提取總RNA，參照潞蛻明書進行逆轉錄合成cDNA，以逆轉錄所得到的cDNA為模板進行RT-PCR。引物序列為：CD4（上游引物：5-TGCCTCAGTATGCTGGCTCT-3，下游引物：5GAGACCTTrGCCTCCTTGTrC-3）；CCR5f上游引物：5-GCTGGTCATCCTCATCCTGATAA-3'，下游引物：5'-ATGGCCAGGTrGAGCAGGTA-3）和GAPDH（上游引物：5一TrCACCACCATGGAGAAGGC-3，下游引物：5-GGCATGGACTGTGGTCATGA-31。通過ABI7500實時熒光定量PCR儀進行檢測，反應程序為：95℃1 min，94℃15 s，60℃1 min，40個循環。

1.2.6 L615細胞的慢病毒轉染及HIV-1感染取對數生長期的小鼠白血病細胞L615，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO₂的培養箱中培養。當細胞融合率達50%左右，加入慢病毒載體，傳代培養。3 d后收集細胞用Trizol法提取總RNA，參照試劑說明書進行逆轉錄合成eDNA，以逆轉錄所得的eDNA為模板進行RT-PCR。7 d后，L615細胞感染HIV-1，收集2、4、6 h上清液提取RNA，進行qRT-PCR檢測。

1.3統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件，實驗數據以x±s表示，兩組之間的比較用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1菌落PCR鑒定hCD4/CCR5

重組質粒puro-CMV-CD4-IRES-CCR5菌落PCR鑒定結果如圖1所示，可見2個陽性條帶，根據設計的引物，目的片段CD4和CCR5的理論大小約為193和75 bp，與其相符，表明CD4和CCR5皆為陽性克隆?？蛰d體（Mock-Vector）Pgk-puro為空白對照。

2.2 PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5全序列

重組質粒puro-CMV-CD4-IRES-CCR5載體的全序列測序結果見圖2，顯示所構建的慢病毒表達載體均含有所設計的目的片段，其序列與設計的puro-CMV-CD4-IRES-CCR5核苷酸序列完全一致，證實目的片段已正確插入PLA.ExBi.P慢病毒載體，成功構建了重組慢病毒載體。

2.3轉染后293T細胞CD4/CCR5基因在mRNA水平的表達

提取轉染后293T細胞中的RNA，進行逆轉錄，以cDNA為模板進行了qRT-PCR檢測，結果如圖3所示：與空的慢病毒載體（N-T）相比，CD4和CCR5mRNA水平的表達量顯著增加（P<0.05）。

2.4轉染L615細胞后的CD4/CCR5 mRNA表達及HIV-1感染檢測結果

L615細胞轉染慢病毒及進行HIV-1感染的結果如圖4所示，圖A為L615細胞感染慢病毒載體第3、5、7天后qRT-PCR檢測結果，其中T表示的是感染有表達hCD4/CCR5慢病毒的L615細胞，Control則是空載病毒對照，顯示轉染后3d、5d和7 d的hCD4和hCCR5的mRNA表達明顯升高（P<0.05）。圖B為轉染后L615細胞被HIV-1感染后上清中qRT-PCR第2、4、6 h檢測結果，其中T表示的是感染HIV-1的L615細胞，Control則是空載病毒對照組，顯示HIV-1RNA轉染后2、4、6 h表達顯著下降，具有統計學意義（P<0.05）。

3討論

CD4分子主要表達于輔助T（Th）細胞，是Th細胞TCR識別抗原的共受體（co-receptor），與MHCⅡ類分子的非多肽區結合，參與Th細胞TCR識別抗原的信號傳導。同時，CD4分子也是HIV的主要受體。CCR5是細胞內β趨化因子[RANTES、（MIP-1）α/CCL3和（MIP-1）β/CCIA]的受體，具有調控T細胞和單核細胞/巨噬細胞系的遷移、增殖與免疫的功能，主要表達于記憶性的靜止期T淋巴細胞、單核細胞、未成熟的樹突狀細胞等的細胞膜上，目前研究亦表明CCR5是HIV-1侵入機體細胞的主要輔助受體之一。HIV-1對宿主細胞具有高度選擇性，僅能感染T4淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等，受體的限制就是其基本原因之一?；诖?，為使非HIV-1宿主細胞可被病毒感染，需克服受體的限制。

慢病毒是一種逆轉錄病毒，它可以將外源的DNA插入到感染細胞的基因組中，有實驗發現慢病毒載體轉染細胞后比其他逆轉錄病毒的致癌性低。與腺病毒載體相比，腺病毒載體攜帶的目的基因不能整合到宿主細胞的基因組中，在傳代的細胞中容易將基因信息丟失，同時一些腺病毒基因產物也會引起細胞凋亡。本實驗選用了慢病毒進行載體構建，首先，加入了REV元件，因為最近的研究表明骨架中含有REV反應元件（RRE）能提高外源基因的表達率，REV元件的存在能使基因組在插入載體時抑制異常連接；其次，將WPRE元件插入在慢病毒載體序列中，WPRE已被證明可以穩定轉錄從而增強了轉基因的表達，加入WPRE元件后，在生產病毒顆粒時能夠增加病毒的滴度；第三，CMV作為CD4-IRES-CCR5的啟動子和IRES雙啟動子作用，CMV作為啟動子不僅能使病毒的滴度提高，而且可以使基因的表達水平增加，能使其在不同類型的細胞中感染效率加強。

本實驗應用Gateway技術，構建重組質粒PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5，將構建好的質粒載體進行了Ndel/BamHI雙酶切鑒定和核苷酸測序分析，結果表明hCD4和hCCR5均正確地插入到了質粒載體中。為了檢測慢病毒包裝后hCD4/CCR5的表達情況，采用qRT-PCR檢測了小鼠白血病細胞L615中hCD4和hCCR5基因在mRNA水平的表達情況，實驗結果表明，與空的慢病毒載體相比，表達hCD4/CCR5分子的慢病毒載體的hCD4/CCR5基因在mRNA水平的表達量相當高，這表明基于表達hCD4/CCR5分子的慢病毒載體是可以成功轉染鼠類細胞的。隨后，轉染后L615細胞進行HIV-1感染，隨著感染時間的延長，上清中HIVRNA表達量有顯著下降，這表明HIV-1病毒順利地入胞于小鼠白血病細胞L615中。也就是說，應用本研究所構建慢病毒載體，轉染后L615細胞可成功表達hCD4及hCCR5分子，促成了鼠類細胞對HIV-1的入胞感染，作為一種構建HIV跨物種細胞模型的轉基因工具，對HIV/AIDS的發病機制、抗病毒研究具有積極的意義。