益氣化瘀方對子宮復舊不全大鼠子宮內膜細胞凋亡相關蛋白的影響

付水冰　曾晶　談珍瑜

摘要：目的 觀察益氣化瘀方對子宮復舊不全大鼠子宮內膜細胞凋亡及Bcl-2、Bax表達的影響，探討其作用機制。方法 40只分娩后SD大鼠隨機分為空白組、模型組、新生化組和益氣低、高劑量組。除空白組外，分娩后，將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌進行子宮內接種制備大鼠炎癥產后子宮復舊不全模型，并于造模后第1-7日分別給予相應藥物灌胃。HE染色觀察各組大鼠子宮切片病理變化；免疫組化檢測子宮內膜組織Bcl-2、Bax蛋白表達。結果 模型組Bcl-2蛋白表達明顯低于空白組（P<0.01），Bax蛋白表達明顯高于空白組（P<0.01）；益氣低、高劑量組和新生化組Bcl-2蛋白表達較模型組均明顯升高（P<0.01），Bax蛋白表達均明顯降低（P<0.01）；益氣低劑量組Bcl-2蛋白表達較新生化組明顯降低（P<0.01），Bax蛋白表達較新生化組明顯升高（P<0.01）。結論 益氣化瘀方可能通過上調Bcl-2、下調Bax蛋白表達，降低子宮內膜細胞凋亡的發(fā)生，促進子宮內膜增生修復，從而促進產后子宮復舊。

關鍵詞：益氣化瘀方；子宮內膜復舊不全；細胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.017

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0059-04

Effects of Yiqi Huayu Decoction on Endometrial Cell Apoptosis Gap-associated Protein in Rat Models of Incomplete Puerperal Involution of Uterus FU Shui-bing1， ZENG Jing2， TAN Zhen-yu2 （1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Yiqi Huayu Decoction on cell apoptosis and Bcl-2， Bax expressions of incomplete puerperal involution of uterus； To discuss its mechanism of action. Methods Forty SD rats were randomly divided into normal group， model group， Xinshenghua group， high- and lower-dose Yiqi groups. The first day after delivery， except for the normal group， rats received intrauterine inoculation with overnight cultured diluted E. coli to establish rat models with incomplete puerperal involution of uterus. They were given corresponding medicine for gavage during day 1-7 after the modeling. Pathological changes in rat uterus slice were observed by HE staining in each group； immunohistochemical detection was used to detect protein expressions of Bcl-2 and Bax in endometrial tissue. Results The protein expression of Bcl-2 in the model group was lower than that in the normal group （P<0.01）， and protein expression of Bax in the model group was higher than that in the normal group （P<0.01）. The protein expression of Bcl-2 in the high- and lower-dose Yiqi groups and Xinshenghua group was higher than that in the model group （P<0.01）， and protein expression of Bax in the high- and lower-dose Yiqi groups and Xinshenghua group was lower than that in the model group （P<0.01）. The protein expression of Bcl-2 in the lower-dose Yiqi group was lower than that in Xinshenghua group （P<0.01）， and protein expression of Bax in the lower-dose Yiqi group was higher than that in Xinshenghua group （P<0.01）. Conclusion Yiqi Huayu Decoction can promote the repair of endometrial hyperplasia and postpartum uterine involution through up-regulating Bcl-2 protein expression and down-regulating Bax protein expression， and reducing the incidence of endometrial cell apoptosis.

Key words： Yiqi Huayu Decoction； incomplete puerperal involution of uterus； apoptosis； Bcl-2； Bax； rats

基金項目：國家自然科學基金青年基金（81202848）；湖南省自然科學基金（14JJ3121）

通訊作者：曾晶，E-mail：841825639@qq.com

近年來，由于人工流產、剖宮產、引產率的上升，隨之發(fā)生的慢性子宮內膜炎升高，子宮復舊不全的發(fā)生率上升，導致產后大出血或者晚期產后出血時有發(fā)生，給產婦造成巨大身體和心理創(chuàng)傷。細胞凋亡是機體一種清除受損、老化異常細胞的生理過程，存在于生命生長發(fā)育的各個時期，包括子宮內膜的周期性變化。子宮內膜能否維持周期性變化和功能穩(wěn)定的關鍵原因在于細胞凋亡的調控。子宮內膜細胞凋亡使子宮內膜發(fā)生周期性的脫落，從而維持子宮內膜的生理作用。益氣化瘀方是湖南中醫(yī)藥大學尤昭玲教授治療產后復舊不良的經驗方。前期實驗表明，益氣化瘀方能降低產后血清中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）水平，抑制子宮螺旋動脈異常舒張，促進子宮內膜的重建與修復[1]。本實驗通過觀察益氣化瘀方對產后子宮復舊不全大鼠子宮內膜細胞凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax表達的影響，探討其是否通過干預細胞調亡促進產后子宮復舊。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級3月齡SD大鼠70只，其中雌鼠50只、雄鼠20只，體質量180～220 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗室。

1.2 藥物

益氣化瘀方由黨參15 g、黃芪15 g、蒲黃10 g、鹿銜草10 g、馬鞭草10 g、茜草10g、烏藥10 g、狗脊10 g、續(xù)斷10 g、甘草6 g等組成，飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，浸膏濃度為4.43 g原藥材/g，批號20120328，滅菌后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｐ律w粒，云南白藥集團股份有限公司，批號ZLB1304，臨床用量36 g/d。

1.3 主要試劑與儀器

大腸桿菌ATCC25922（湖南中醫(yī)藥大學實驗中心），HE染色液、飽和苦味酸（南京建成生物試劑有限公司），Bax、Bcl-2免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），4%多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），10%水合氯醛（天津市科密歐化統(tǒng)一制劑）。YJ-450型超凈工作臺（蘇州進化設備有限公司），MDF-U5411型超低溫冰箱（三洋公司），LEICADMLB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥

分娩后SD大鼠40只，按體質量由高到低進行分層，選取隨機數(shù)字表中任意一行數(shù)字進行分組，隨機分為空白組、模型組、新生化組和益氣低、高劑量組，每組8只。參考文獻[2]方法，造模大鼠進行子宮內接種大腸桿菌（稀釋成1.0×107個/mL），子宮接種量為0.2 mL。造模后第2日隨機處死1只雌鼠，行子宮切片提示子宮復舊不良，子宮黏膜充血、出血，雌激素水平低，并有大量炎性細胞浸潤，表明造模成功。益氣低、高劑量組分別于造模后第1日開始，每日灌胃相應劑量益氣化瘀方水煎液，相當于成人等效劑量的1、2倍，灌胃體積為8 mL/（kg·d）；新生化組給予5.4 g/kg新生化顆粒灌胃；模型組和空白組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)7 d。

2.2 病理學觀察

HE染色鏡下觀察其病理變化。主要步驟：取材，固定后石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟（二甲苯2×5 min）；乙醇水化至水洗；蘇木素浸染5 min，蒸餾水洗片刻；分化液（鹽酸乙醇）5～30 s，蒸餾水沖洗1 min；伊紅染色30 s，蒸餾水沖洗30 s；乙醇脫水；二甲苯透明2×2 min；中性樹脂封片，避免產生氣泡。

2.3 免疫組化檢測子宮內膜組織Bcl-2、Bax表達

末次灌胃2 h采血后脫頸處死大鼠。將取出的子宮組織切片，經二甲苯2×10 min，依次經梯度乙醇后入水；pH 7.4 PBS沖洗3次；新配制甲醇和H202阻斷內源性過氧化酶，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；0.01 mol/L枸櫞酸修復液煮沸，停止加熱，再用蒸餾水沖洗缸子，加速冷卻至室溫約15 min，PBS洗滌3次；加入適合比例的一抗（兔抗鼠Bax、Bcl-2），置于4 ℃冰箱過夜；滴加生物素化二抗，恒溫箱內孵育約30 min，PBS沖洗3次；使用前配制DAB溶液，30 min內使用；滴加DAB顯色液，鏡下控制反應至背景顯色5 min；蒸餾水充分沖洗；蘇木精淺染后，蒸餾水沖洗干凈；各級梯度乙醇分別脫水5 min；二甲苯中透明中性樹脂封片，防止氣泡發(fā)生。光鏡觀察并拍照。以已知的Bcl-2陽性圖片作陽性對照。細胞核棕黃色為陽性反應細胞。免疫組化染色隨機觀察5個不重疊視野，應用醫(yī)學數(shù)碼圖像儀分析計算Bcl-2、Bax灰度值，取平均值作為大鼠的檢測值。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。所有計量料資若滿足正態(tài)分布，符合方差性齊采用方差分析，方差不齊時采用非參數(shù)秩和方法檢驗。P<0.05表示差異有計統(tǒng)學意義。

4 結果

4.1 子宮內膜組織HE染色結果

空白組大鼠子宮內膜偶有連續(xù)性部分間斷，上皮細胞輕度脫落，腺體數(shù)目少；模型組與空白組比較，子宮內膜連續(xù)性部分中斷，且子宮內膜部分小血管擴張、充血，上皮細胞壞死脫落，大量炎性細胞浸潤，間質疏松水腫；新生化組和益氣高劑量組子宮內膜連續(xù)性好，未見中斷，無明顯上皮損傷，未見明顯炎性細胞浸潤，腺體數(shù)目多，未見血管擴張、充血，間質致密，宮腔中無明顯滲血、滲液；益氣低劑量組子宮內膜可見少量連續(xù)性中斷，內膜上皮損傷較輕，間質較致密，炎細胞少。結果見圖1。

4.2 益氣化瘀方對大鼠子宮內膜細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組Bcl-2蛋白表達明顯下降、Bax蛋白表達升高（P<0.01）；與模型組比較，益氣低、高劑量組及新生化組Bcl-2蛋白表達升高、Bax蛋白表達降低（P<0.01）；與新生化組比較，益氣低劑量組Bcl-2蛋白表達降低、Bax蛋白表達升高（P<0.01），益氣高劑量組Bcl-2、Bax蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見圖2、圖3、表1。

5 討論

程序化細胞死亡也被稱為細胞凋亡，指細胞通過凋亡信號刺激時，啟動細胞內死亡機制，通過一系列信號傳播，最后演變?yōu)楦叨扔行虻募毎劳觥Ｔ谡Ｉ磉^程，細胞凋亡維持著動態(tài)平衡。若細胞凋亡動態(tài)平衡失去控制，導致細胞過度增生或凋亡，可引起子宮內膜異位癥、卵巢癌等[3]。Bcl-2和Bax蛋白分別是Bcl-2基因家族中最有代表性的凋亡抑制因子和凋亡促進因子，且Bax還參與調控Bcl-2的活性。近年來研究表明，子宮內膜存在細胞凋亡并受凋亡調節(jié)因子的調控[4]。子宮內膜細胞凋亡和增生保持動態(tài)平衡，使子宮內膜保持周期性變化，從而維持子宮內膜的生理作用。子宮內膜的周期性生長和重建與細胞凋亡密切相關。Bax蛋白主要誘導細胞凋亡，抑制內膜過度增生；Bcl-2蛋白則抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，內膜修復增生[5-6]。

根據(jù)其臨床表現(xiàn)，產后子宮復舊不全可其歸于中醫(yī)“產后惡露不絕”范疇，又稱“惡露不止”。唐代孫思邈《備急千金要方》曰：“婦人產后，五臟皆羸弱。”宋代陳自明《婦人大全良方》云：“產后臟腑勞傷，氣血虛損……致惡露不下。”清代閻純璽《胎產心法》有言：“產時耗傷氣血經絡，氣虛不能收斂，或者瘀血不去，新血難歸經，相并而下，日久難以止住。”產后惡露淋漓不絕與氣虛無力攝血或瘀血內阻等有關，產后氣虛攝血無力可致惡露不絕，瘀血內阻、血不歸經也可使惡露不絕。其病機為瘀血阻滯胞宮、沖任，不能歸經，離經之血致惡露不絕。對于產后疾病的原因，歷代醫(yī)家大多著眼于產后氣血虧虛、瘀血內阻這一內因。

益氣化瘀方以益氣化瘀、扶正祛邪為法，功專益氣攝血、化瘀止痛，虛實標本兼治，且化瘀不耗氣、止血不留瘀，是治療產后惡露不盡、陰道不規(guī)則流血、小腹疼痛的良方。黨參和蒲黃為方中君藥。黨參味甘，補益脾肺、生津；蒲黃味甘微辛、味平，活血化瘀、止血；黃芪、馬鞭草、茜草共為臣藥。黃芪味甘、性微溫，補氣升陽、益衛(wèi)固表；馬鞭草味苦、性涼，活血化瘀；茜草味苦、性寒，涼血止血、祛瘀通經。鹿銜草、烏藥、狗脊、續(xù)斷同為佐藥。鹿銜草味甘、苦，性溫，祛風除濕、補腎強骨、止血；烏藥味辛、性溫，順氣止痛、溫腎散寒；狗脊味甘、苦，性溫，補肝腎、強腰膝、止血；續(xù)斷味苦、甘、辛，性微溫、補肝腎、強筋骨、止血。甘草為使藥，味甘、性平，補脾益氣、清熱解毒、解痙止痛，調和方中諸藥。諸藥合用，扶正祛邪、益氣化瘀，使補益不礙邪，化瘀不傷正，從而促進惡露盡快排出，并且補益氣血，促進產后恢復。

本實驗免疫組化結果顯示，益氣化瘀方可降低產后子宮復舊不良大鼠子宮內膜損傷程度，修復子宮內膜，促進產后子宮復舊。此作用可能通過上調Bcl-2、下調Bax蛋白表達，降低子宮內膜細胞凋亡的發(fā)生而實現(xiàn)的。

參考文獻：

[1] 張秀麗，曾晶，付水冰，等.益氣化瘀方對產后子宮復舊不全大鼠一氧化氮和一氧化氮合酶的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（6）：58-60.

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[4] 盧寧，佟繼銘，劉夢杰.大黃水提物對成年雌性大鼠子宮中Bcl-2、Bax 表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（7）：1605-1606.

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（收稿日期：2015-05-13）

（修回日期：2015-06-07；編輯：華強）