犬瘟熱分子生物學診斷技術研究進展

左　楠

(哈爾濱市動物衛生防疫站，哈爾濱 150016)

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犬瘟熱分子生物學診斷技術研究進展

左楠

(哈爾濱市動物衛生防疫站，哈爾濱 150016)

摘要：犬瘟熱是目前危害犬、毛皮動物和野生動物最嚴重的傳染病之一。其臨床癥狀復雜，大多存在混合感染，確診尤其是早期診斷較為困難。早期診斷對于犬瘟熱的綜合防控和患病動物的救治具有重要的作用，近年來分子生物學診斷技術的不斷發展，對犬瘟熱的診斷具有重要意義。現對犬瘟熱的分子生物學診斷方法等作一綜述。

關鍵詞：犬瘟熱；早期診斷；分子生物學

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬科、鼬科和浣熊科等多種肉食性動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。犬瘟熱最早發現于18世紀后葉，1905年有人發現其病原為一種病毒。我國于1980年從患病犬體內分離到此病毒[1]。犬瘟熱的臨床表現多樣，特征性的示病癥狀很少出現，大多存在混合感染，因此準確、快速、特異性強的早期診斷方法在獸醫臨床中越來越重要。

1病原與癥狀

CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，為有囊膜的單股、負鏈RNA病毒，病毒粒子呈多形性，直徑一般在100～300nm之間。其抵抗力不強，對熱、干燥、紫外線和有機溶劑敏感[2]。

犬瘟熱的臨床癥狀依所處環境、感染毒株、感染動物年齡和免疫狀態的不同而呈現多樣性。病犬主要表現為雙相熱，呼吸道癥狀如呼吸道卡他性炎癥，神經癥狀如肌肉痙攣和癲癇等，消化道癥狀如腹瀉、嘔吐和脫水等。病程一般為2周或稍長，發生卡他性肺炎和腸炎時病程可能較長，出現神經癥狀的病程最長。

2常規檢測與診斷

依據臨床癥狀和流行病學特點，可作出初步診斷，但犬瘟熱病毒常與其他病毒混合感染，或引起細菌的繼發感染，因此犬瘟熱的臨床癥狀表現復雜，只有將臨床癥狀與實驗室診斷相結合才能進行確診。常見的實驗室診斷方法有CDV的分離培養及鑒定、電子顯微鏡直觀觀察診斷和血清學檢測與診斷等。其中血清學診斷在犬瘟熱的實驗室診斷中是較為可靠的診斷方法。相繼建立起了補體結合實驗、微量血清中和實驗、免疫熒光試驗等檢測和診斷方法，其中免疫熒光技術是目前國際通用的犬瘟熱診斷方法[3]。

3分子生物學檢測與診斷

犬瘟熱的確診較為困難，尤其是早期診斷。但是隨著分子生物學的發展，國內外先后建立了犬瘟熱的核酸雜交等溫擴增等分子生物學診斷技術，其方法比免疫學方法的敏感性和特異性更高，尤其在CDV的感染早期，尚未產生免疫應答的情況下分子生物學方法能夠作出早期診斷。

3.1核酸雜交

核酸雜交是一種分子生物學的檢測技術，用放射性或非放射性物質標記的已知序列的單鏈DNA或RNA片段(探針)，檢測樣品中的DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)，經放射自顯影或顯色反應將與探針特異性結合的靶序列顯示出來，其敏感性高、特異性強。在應用核酸雜交技術對犬瘟熱進行診斷方面，國內報道較少，國外研究較多。Appel[4]用DNA探針和單股RNA探針檢測了CDV基因組和mRNA，獲得了很高的靈敏度和特異性。Zurbriggen等[5]用地高辛標記犬瘟熱病毒NP基因互補的RNA作為探針，可檢測到單個細胞中存在的犬瘟熱核苷酸序列。王宏俊等[6]在CDV基因序列中編碼核衣殼蛋白的保守區內設計合成一對特異性引物，通過RT-PCR從CDV基因中擴增出一段430bp的cDNA，并制備出地高辛標記的核酸探針，經檢測結果表明該探針可用于CDV的臨床檢測。

3.2聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(PCR)作為一種體外擴增DNA片段的技術已廣泛用于DNA病毒特異性核酸的檢測，具有省時、省力、敏感性和特異性高等優點。國內外已有許多通過RT-PCR檢測CDV的報道。肖定福[7]等根據CDV的NP基因設計一對引物，使用RT-PCR方法，從臨床疑似CDV感染犬的淋巴細胞中檢測到目的條帶(287bp)，表明該引物與反應條件適合于檢測犬CDV感染。張洪亮等[8]根據CDV疫苗株和野毒株H基因序列Nde Ⅰ酶切位點的不同，建立了RT-PCR擴增產物經限制性片段長度多態性分析(RELP)鑒別檢測方法，為臨床上犬瘟熱病毒的鑒別檢測和診斷提供了依據。

3.3實時定量PCR

實時定量PCR(Real-time PCR)是在PCR的基礎上發展起來的一種新的核酸檢測技術，比普通PCR更迅速、靈敏、特異性強。目前實時定量PCR檢測方法主要有SYBR Green熒光染料摻入法和TaqMan探針法。TaqMan探針法特異性好，但是價格比較昂貴，染料法價格較為低廉，敏感性、特異性等也較好。黃國君等[9]根據犬瘟熱病毒NP基因序列，設計合成引物，建立了基于SYBR Green Ⅰ的Real-time RT-PCR檢測CDV的方法，與常規RT-PCR及膠體金檢測技術(GIA)進行了比較，結果表明敏感性比常規RT-PCR高103，比GIA高105。檢測11例臨床病例，檢出率100%，為CDV的早期快速診斷提供了新的定量檢測方法。全傳松等[10]建立的TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法，其敏感性是常規RT-PCR的100倍，與其他犬類病毒不發生交叉反應。對67份臨床樣品檢測，陽性檢出率為64.2%，高于常規RT-PCR陽性檢出率20%，具有良好的敏感性、特異性和穩定性。

3.4環介導等溫擴增

環介導等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年日本學者Notomi等報道的一種新的恒溫核酸擴增技術，是針對靶基因的6個區域設計4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，在等溫條件下(60～65℃)，1h完成核酸擴增。擴增反應產生焦磷酸鎂白色沉淀，可通過肉眼來判斷是否發生擴增。LAMP技術已在食品檢測、臨床疾病診斷等領域有著廣泛的應用。何麗麗等[11]根據犬瘟熱病毒N基因設計2對LAMP引物，建立CDV環介導等溫擴增檢測方法。經檢測，結果顯示，該方法敏感性比RT-PCR高10倍，僅CDV產生陽性擴增，狂犬病毒、犬細小病毒和犬腺病毒Ⅱ型擴增結果均為陰性，臨床樣品檢測結果與RT-PCR一致。楊天闊等[12]建立了鑒別CDV野毒株與疫苗株的反轉錄-環介導等溫擴增方法(RT-LAMP)，對反應體系和條件進行了優化，方法特異性高，敏感度是常規RT-PCR的100倍。

4小結

犬瘟熱作為對毛皮動物、犬和野生動物危害最嚴重的疾病之一，每年都會造成巨大的經濟損失。由于其診斷復雜和困難，需要實驗室診斷技術來進行確診。雖然已有多種診斷方法成功應用于診斷，但在實際推廣應用上仍存在一些問題。隨著科學技術的不斷發展，分子生物學的研究逐漸深入，新的分子生物學技術不斷推出和完善，準確、快速、簡便的對犬瘟熱進行診斷和監測將逐步實現，對于犬瘟熱的綜合防控和有效治療，保護毛皮動物養殖業、保障寵物犬和野生動物的健康具有重大意義。

參考文獻:

[1] 夏咸柱．養犬大全[M]．吉林：吉林人民出版社，1993:549-553.

[2] 殷震，劉景華．動物病毒學[M]．北京：科學出版社，1997.

[3] 黎映勝．犬瘟熱診斷方法的研究進展[J]．甘肅畜牧獸醫，2009(6):43-46.

[4] Appel M J. Canine distemper virus infection and encephalitis in javalias[J]. Arch Virol,1991:147-152.

[5] Zurbriggen A, Muller C, Vandenelde M. In Situ hybridization of virulent canine distemper virus in brain tissue using digoxigenin-labeled prober[J]. Am J Vet Res, 1993,54(9):1457-1459.

[6] 王宏俊，丁少忠.核酸探針檢測犬瘟熱病毒方法的建立和初步應用[J].中國獸藥雜志，2006,40(5):19-22.

[7] 肖定福，張匯東，李文平，等.RT-PCR檢測寵物犬的犬瘟熱病毒[J].經濟動物學報，2005,9(4):221-224.

[8] 張洪亮，張傳美，王聰，等.鑒別犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株RT-PCR-RFLP方法的建立及應用[J].中國獸醫學報，2013,33(11):1647-1656.

[9] 黃國君，岳華，楊發龍，等.SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測犬瘟熱病毒方法的建立及應用[J].中國預防獸醫學報，2008,30(6):450-454.

[10] 全傳松，李博韜，姜騫，等.犬瘟熱病毒TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學，2014,44(6):589-592.

[11] 何麗麗，關瑋琨，江馗語，等.犬瘟熱病毒N基因環介導等溫擴增檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2013,35(2):138-141.

低產品種下降9%～10%；最初數月下降速度較慢，到泌乳末期，泌乳量迅速下降。初乳期內的乳脂率很高，第2～8周乳脂率最低。第三個泌乳月開始，乳脂率又逐漸上升。

文章編號：2095-9737(2016)01-050-02

中圖分類號：S858.292

文獻標識碼：A

作者簡介：左楠(1981-)，男，黑龍江佳木斯人，碩士，獸醫師，主要從事動物疫病防控、畜牧獸醫技術推廣及科研工作。

收稿日期：2015-09-21