miR-34a逆轉非小細胞肺癌A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性及其機制

劉明明　劉永俠　付子毅

(東南大學附屬中大醫院，江蘇　南京　210000)

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miR-34a逆轉非小細胞肺癌A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性及其機制

劉明明劉永俠付子毅1

(東南大學附屬中大醫院，江蘇南京210000)

摘要〔〕目的探討過表達miR-34a對非小細胞肺癌A549/DDP細胞順鉑(DDP)耐藥性的影響及可能機制。方法成功構建過表達miR-34a的真核載體pCDNA3.1+miR-34a后，將A549/DDP細胞分為對照組(無轉染)、空轉染組(轉染空質粒)和過表達組(轉染pCDNA3.1+miR-34a)，采用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測轉染24、48、72及96 h后各組miR-34a水平；給予不同濃度DDP(2、4、8、16、32和64 μg/ml)處理48 h后采用CCK-8法比較各組對DDP的敏感性，流式細胞儀PI/Annexin V雙染法檢測各組轉染48、96 h后的凋亡率，分別采用Western印跡檢測各組轉染48、96 h后常見耐藥基因的表達情況。結果A549/DDP細胞的miR-34a水平均低于其親本細胞A549和正常支氣管上皮細胞系HBE(P<0.05)；與其余兩組相比，過表達組轉染后的miR-34a水平升高，且對A549/DDP細胞的增殖抑制率升高(P<0.05)；過表達組的半數抑制濃度均低于其余兩組，過表達組轉染48、96 h后的凋亡率高于其余兩組，而轉染48 h后的P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白1及肺耐藥相關蛋白的水平低于其余兩組(P<0.05)；對照組和空轉染組以上指標的差異均無統計學意義(P>0.05)。結論A549/DDP細胞中miR-34a水平較低，通過真核載體將其過表達后可抑制增殖率并提高其對DDP的敏感性，可能與其誘導凋亡及降低耐藥基因的表達有關。

關鍵詞〔〕miR-34a；非小細胞肺癌；順鉑；耐藥性

1南京醫科大學附屬南京市婦幼保健院醫學研究中心

第一作者：劉明明(1984-)，女，藥師，主要從事藥物分析等藥學方面的研究。

由于肺癌癥狀不明顯，發病較為隱匿，多數確診時已為晚期，故系統化療仍為主要治療手段，但目前較為常見的化療耐藥限制了其效果，尋找逆轉化療耐藥的潛在策略已成為肺癌防治的熱點〔1～3〕。多項研究指出miRNA表達異常介導了腫瘤化療耐藥過程，提示篩選在化療耐藥過程中異常表達的miRNA可能有一定參考價值〔4,5〕。miR-34a在多種腫瘤組織中低表達，且參與了多種腫瘤的化療耐藥〔6，7〕，但目前其在肺癌化療耐藥中的作用尚不清楚。本研究選用A549細胞的順鉑(DDP)耐藥肺腺癌細胞系株A549/DDP進行相關實驗，通過目前常用的真核過表達體系pCDNA3.1+miR-34a上調其表達，進一步觀察對其DDP敏感性的影響。

1資料與方法

1.1主要試劑A549及A549/DDP細胞購自中國醫學科學院上海細胞庫，RPMI1640培養液、胎牛血清及RNA快速抽提純化(Trizol)試劑盒購自美國GIBCO公司，脂質體Lipofectamine 2000TM購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，Power SYBR Green PCR Master Min購于美國LifeTechnologies公司，miR-34a引物及過表達miR-34a的真核重組質粒pCDNA3.1+miR-34a由上海生工生物工程技術服務有限公司構建，小鼠抗人肺耐藥相關蛋白(LRP)單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗人P-糖蛋白(P-gp)單克隆抗體、多藥耐藥相關蛋白(MRP)1單克隆抗體均購自英國Abcam公司，抗山羊和抗小鼠辣根過氧化物酶耦聯的二抗購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2細胞培養將凍存于液氮中的細胞復蘇后采用RPMI 1640培養液進行常規條件培養(溫度保持在37℃、CO2濃度為5%及100%濕度)，A549、A549/DDP細胞均用含10%滅活胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養液培養。此外，用于A549/DDP細胞培養的RPMI 1640培養液中添加DDP并調整終濃度至1 μg/ml。待以上兩種細胞達對數生長時，進行傳代及后續實驗。根據實驗設計將對數生長的A549/DDP細胞分為對照組、空轉染組和過表達組，對照組不行轉染處理，過表達組通過脂質體 lipofectamine 2000將pCDNA3.1+miR-34a過表達載體轉染至A549/DDP細胞，空轉染組則轉染空質粒；分別于轉染24、48、72和96 h后提取各組RNA，采用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測各組miR-34a水平。

1.3qPCR檢測收集各組轉染后不同時間點的細胞，采用Trizol提取總RNA，并按照試劑盒說明書依次進行cDNA合成及qPCR反應。(1)cDNA合成的逆轉錄體系體積為20 μl：總RNA 1 μg、5×逆轉錄反應緩沖液4 μl、M-MLV逆轉錄酶200 U、隨機引物200 ng、10 mmol/L dNTP 1 μl及RNasin 20 U，采用ddH2O 補齊至20 μl。反應條件：42℃ 60 min；70℃ 10 min。(2)取5.0 μl cDNA進行PCR擴增反應，反應條件為95 ℃ 預變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。采用U6作為內參。采用Ct值法(2-△△CT)進行相對定量分析。

1.4CCK-8法(1)采用CCK-8試劑盒檢測轉染pCDNA3.1+miR-34a對A549/DDP細胞增殖的影響，分別于轉染24、48、72、96 h后，經0.25%胰酶消化并制備單細胞懸液，每孔加入10 μl CCK-8試劑，培養箱繼續孵育4 h后，采用酶標儀比色法檢測各組細胞在450 nm波長下的吸光值(A)，根據公式計算增殖抑制率：抑制率=(1-A其余處理組)/A對照組×100%。(2)采用CCK-8試劑盒檢測A549/DDP細胞對DDP敏感性變化，向單細胞懸液加入濃度梯度的DDP(2、4、8、16、32和64 μg/ml)，轉染48 h后加入CCK-8并檢測A，根據增殖抑制率公式計算DDP的半數抑制濃度(IC50)。每組設5個平行孔。

1.6流式細胞術采用RPMI1640培養液將A549/DDP細胞調整至1×105個/ml，接種于96孔培養板中，分別于轉染48、96 h后收集各組細胞，采用75%冷乙醇于4℃固定過夜后，加入終濃度200 μg/ml RNase A，向各組細胞中加入Annexin V/FITC和PI進行雙標染色，染色15 min后采用FAC SAria流式細胞儀測定早、晚期凋亡率。

1.7Western印跡轉染48 h后收集各組細胞 5×106個，采用RIPA細胞裂解液裂解A549/DDP細胞，提取總蛋白并采用Lowry法檢測蛋白濃度。每孔取40 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后采用半干轉法將蛋白印跡轉移至PVDF膜上(孔徑為0.45 μm)，經5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入P-gp、MRP1及LRP的一抗，覆蓋PVDF膜后4℃冰箱過夜，稀釋度依次為1∶200、1∶300和1∶200，TBST緩沖液洗膜3次，加二抗(1∶3 000稀釋)，37℃孵育1 h，TBST洗膜后采用ECL發光試劑盒發光，曝光、顯影、定影后進行目的條帶光密度分析，最終結果為目的條帶光密度與內參GAPDH的比值。

1.8統計學分析采用SPSS15.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2結果

2.1A549/DDP細胞的miR-34a水平A549/DDP細胞的miR-34a水平(0.45±0.06)低于其親本細胞A549(0.75±0.11)和正常支氣管上皮細胞系HBE(1.03±0.09)，且A549的miR-34a水平亦低于HBE(P<0.05)。轉染24、48、72及96 h后，過表達組的miR-34a水平均高于對照組和空轉染組(P<0.05)，轉染96 h后過表達組的miR-34a水平分別升高至對照組的(6.21±0.74)倍和空轉染組的(6.34±0.90)倍，且對照組和空轉染組不同轉染時間點miR-34a水平無統計學差異(P>0.05)，見圖1。

圖1　轉染后A549/DDP細胞的miR-34a水平變化

2.2過表達miR-34a對A549/DDP細胞增殖的影響與其余兩組比較，過表達組的增殖抑制率升高(P<0.05)，且對照組和空轉染組各時間點均無統計學差異(P>0.05)；過表達組中隨著轉染時間的延長，增殖抑制率升高，且轉染96 h后的增殖抑制率為(55.69±4.05)%，均高于其余時間點(P<0.05)。見表1。

表1　過表達miR-34a對A549/DDP細胞增殖率的影響

與空轉染組比較：1)P<0.05

2.3過表達miR-34a對A549/DDP細胞DDP耐藥的影響轉染48 h后，對照組、空轉染組和過表達組的IC50值依次為(36.02±2.93)、(34.66±2.70)和(14.52±1.78)μg/ml，過表達組的IC50值均低于其余兩組(P<0.05)，且對照組和空轉染組無統計學差異(P>0.05)。

2.4過表達miR-34a對A549/DDP細胞凋亡的影響過表達組轉染48、96 h后的凋亡率均高于對照組和空轉染組，且過表達96 h后的早、晚期凋亡率高于48 h(P<0.05)；對照組和空轉染組轉染48、96 h后凋亡率無統計學差異(P>0.05)，見表2。

表2　過表達miR-34a對A549/DDP細胞凋亡率的

對照組比較：1)P<0.05；與空轉染組比較：2)P<0.05；與48 h比較：3)P<0.05

2.5過表達miR-34a對A549/DDP細胞耐藥相關蛋白的影響過表達組轉染48 h后的P-gp、MRP1及LRP蛋白水平均低于對照組和空轉染組(P<0.05)；對照組和空轉染組耐藥相關蛋白無統計學差異(P>0.05)，見表3，圖2。

表3　過表達miR-34a對A549/DDP細胞耐藥相關蛋白的

與對照組比較：1)P<0.05；與空轉染組比較：2)P<0.05

圖2　過表達miR-34a對A549/DDP細胞耐藥相關蛋白的影響

3討論

近期研究發現miR-34a介導了多種腫瘤的耐藥，通過外源模擬物或質粒載體上調其水平可起到逆轉耐藥或重建對化療藥物敏感性的效果〔8，9〕，提示上調miR-34a水平可能為一種潛在的逆轉策略。何靜等〔8〕發現miR-34a在乳腺癌細胞株MCF-7和耐藥株MCF7/ADR中存在表達差異，而在耐藥細胞株中呈下調趨勢，本研究亦發現A549/DDP中的miR-34a水平低于其親本A549，與何靜等〔8〕的結果一致，表明miR-34a參與了多種腫瘤的化療耐藥過程。此外，miR-34a在胰腺癌細胞獲得性耐藥中發揮一定作用，如劉林〔7〕發現miR-34a表達減少參與了胰腺癌細胞株SW1990細胞對5氟尿嘧啶獲得性耐藥。以上結果進一步提示miR-34a表達減少在腫瘤化療耐藥中發揮正向促進作用。通過轉染過表達miR-34a的質粒載體或其模擬物miR-34a mimics可增強某些腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，如MCF-7/ADR對于多柔比星的敏感性〔8〕和SW1990細胞對5氟尿嘧啶的敏感性〔9〕。同時，miR-34重建對p53缺陷腫瘤的化療耐藥性亦有一定逆轉效果〔10〕。

本研究發現，在轉染24 h后即可發現miR-34a水平升高，且上調效果可持續至96 h，表明載體構建較為成功，而空轉染組miR-34a水平與對照組無統計學差異，說明該載體安全可靠，避免了對研究的影響。將轉染成功的A549/DDP細胞暴露在濃度梯度的DDP中發現，過表達后的細胞對DDP的敏感性增強，主要表現在DDP對A549/DDP細胞的IC50降低，證實過表達miR-34a有助于逆轉肺癌細胞的化療耐藥，驗證了本研究之前的假設，與相關報道的結論〔9，10〕一致。此外，本研究亦發現過表達miR-34a A549/DDP細胞的增殖抑制率升高，提示過表達miR-34a可影響腫瘤細胞的增殖，并且過表達組細胞出現細胞體積變小、核固縮等凋亡表現。流式細胞儀檢測結果提示miR-34a本身具有抑癌基因的效果，總體上miR-34a增加A549/DDP細胞對DDP的敏感性，有逆轉耐藥的潛能。

多項研究指出逆轉耐藥的潛在策略同樣可影響耐藥蛋白的相關表達〔11〕。本研究發現過表達miR-34a后，3種在肺癌中常見的耐藥蛋白(LRP、P-gp和MRP1)水平均降低，且MRP1的降低幅度最大，推測可能為miR-34a發揮逆轉潛在的途徑。此外，有研究發現miR-34a還可通過多種途徑逆轉耐藥，如Wu等〔12〕發現miR-34a可通過靶向 HDAC1和 HDAC7 來調控乳腺癌化療中的耐藥過程。綜上所述，A549/DDP細胞中miR-34a水平較低，通過真核載體將其過表達后可提高其對DDP的敏感性從而達到逆轉耐藥的效果，可能與其抑制增殖、誘導凋亡及降低耐藥基因的表達有關，上調miR-34a可能在逆轉肺癌細胞化療耐藥中有一定價值。

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〔2015-04-19修回〕

(編輯徐杰)

中圖分類號〔〕R735〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0052-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.023