山楂葉總黃酮對慢性腦缺血大鼠腦組織c-fos、Bcl-2蛋白表達的影響

吳曉光　檀榮方　楊　嵐　李蒙蒙　張天鴿　張　強

(河北省中醫藥抗癡呆重點研究室，河北　承德　067000)

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山楂葉總黃酮對慢性腦缺血大鼠腦組織c-fos、Bcl-2蛋白表達的影響

吳曉光檀榮方楊嵐李蒙蒙張天鴿張強

(河北省中醫藥抗癡呆重點研究室，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討山楂葉總黃酮(TFHL)對慢性腦缺血大鼠的治療作用及機制。方法健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、TFHL組、銀杏葉片組。采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備腦缺血模型。免疫組化法檢測c-fos蛋白的表達，Western印跡法檢測Bcl-2蛋白的表達，原子分光光度法檢測腦組織Ca2+含量。結果與模型組比較，TFHL顯著抑制大鼠缺血腦組織c-fos蛋白表達(P<0.01)，增加Bcl-2蛋白表達(P<0.05)，降低Ca2+含量(P<0.05)。結論TFHL對慢性腦缺血的保護作用與抑制腦神經細胞凋亡有關，其抗凋亡的機制可能與上調Bcl-2表達，下調c-fos表達，降低腦組織Ca2+含量有關。

關鍵詞〔〕山楂葉總黃酮；慢性腦缺血；c-fos；Bcl-2；Ca2+

第一作者：吳曉光(1975-)，男，碩士，副研究員，碩士生導師，主要從事中醫藥抗癡呆機制研究。

細胞凋亡與缺血性腦損傷的關系極為密切。腦缺血后，c-fos的過度表達能阻斷細胞內信號的轉導而產生一些促調亡因子〔1〕，參與腦缺血損傷后的神經細胞凋亡過程。Bcl-2是抑制細胞凋亡因子，與細胞凋亡密切相關，抑制或減少損傷后神經細胞凋亡成為缺血性腦血管病治療的關鍵〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)是從山楂葉中提取的黃酮類化合物，具有降血脂、抗氧化等〔3〕功能，但其對c-fos和Bcl-2基因表達的影響尚不清楚。本研究采用雙側頸總動脈結扎法制備慢性腦缺血模型，觀察TFHL對腦缺血大鼠c-fos、Bcl-2表達的影響，并探討其可能機制，為防治缺血性腦血管病提供實驗依據。

1材料與方法

1.1藥物與試劑摘采承德本地7～8月份的山楂樹葉，采用水煎醇沉法〔4〕提取TFHL，純度為65.2%。c-fos、Bcl-2多克隆抗體(武漢博士德生物科技有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司)。

1.2動物模型制備及分組清潔級SD大鼠72只，雄性，體質量250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供〔格證號：scxk(京)2012-0001〕。隨機分等為四組：假手術組、模型組、TFHL組、銀杏葉片組。采用雙側頸總動脈結扎法建立大鼠腦缺血模型〔5〕，假手術組僅分離雙側頸總動脈，不結扎。術后第7天開始，TFHL組及銀杏葉片組大鼠分別灌胃給予TFHL 140 mg·kg-1·d-1和銀杏葉片12.3 mg·kg-1·d-1，共21 d。假手術組及模型組給予等量的生理鹽水。

1.3觀察指標及方法

1.3.1免疫組化檢測c-fos蛋白的表達末次給藥后1 h，4%水合氯醛麻醉，10% 甲醛心臟灌注固定，取視交叉后2～8 mm之間的腦組織，常規石蠟包埋，5 μm厚冠狀面切片。切片經過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，0.3%H2O2孵育30 min，山羊血清封閉30 min，滴加c-fos一抗(1∶100)40 μl，4℃冰箱過夜，生物素標記羊抗兔IgG 50 μl孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察，拍片。MINT圖像分析系統分析陽性表達產物的光密度值。

1.3.2Western印跡法檢測Bcl-2蛋白的表達末次給藥后1 h，0.01 mol/L PBS洗凈血液，加入裂解液和10 μl PMSF(10 mg/ml)，4℃勻漿，10 000 r/min，離心30 min ，取上清液，BAC蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。再經過SDS-PAGE電泳、轉膜、10%脫脂奶粉封閉，加Bcl-2一抗(1∶150)4℃過夜，HRP標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2.5 h，Super ECL Plus 超敏發光液發光，X線片暗盒內曝光，D72顯影液顯影，利用Quantity One軟件分析X線膠片的灰度值。

1.3.3原子分光光度法檢測Ca2+含量末次給藥后1 h，大鼠斷頭，取腦組織，剝離軟腦膜，超純水漂洗，去除殘余血液，60℃溫箱烘烤48 h，分析天平稱重，滴加濃硝酸，逐漸全部消化成溶液，取樣，1%CaCl2稀釋，利用原子分光光度法檢測樣品Ca2+含量。

1.4統計學方法采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1各組大鼠腦組織c-fos蛋白的表達與假手術組比較，模型組c-fos蛋白升高(324.78.94±50.37)%〔(0.046 3±0.005 83)，P<0.01〕；與模型組比較，銀杏葉片組(0.016 8±0.000 54)和TFHL組(0.017 6±0.000 61)的c-fos蛋白分別降低了(63.71±11.42)%和(61.98±11.27)%，具有顯著差異(P<0.01)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無差異(P>0.05)。見表1，圖1。

圖1　各組大鼠腦組織c-fos蛋白的表達(DAB，×400)

2.2各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達假手術組(0.28±0.02)有少量的Bcl-2蛋白表達。與假手術組比較，模型組Bcl-2蛋白的表達升高(17.89±3.19)% (0.33±0.06，P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉片組(0.70±0.08)和TFHL組(0.68±0.09)的Bcl-2蛋白的表達明顯增高(112.12±6.14)%和(106.01±5.81)%，具有顯著差異(P<0.01)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無差異(P>0.05)。見圖2。

圖2　各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達

2.3各組大鼠腦組織Ca2+的含量模型組大鼠腦組織Ca2+含量較假手術組顯著增加(117.20±5.18)%〔(231.51±11.47)vs(106.59±6.87)μg/g，P<0.01〕；與模型組比較，銀杏葉片組〔(142.32±5.17)μg/g〕和TFHL組〔(145.91±5.78)μg/g〕腦組織Ca2+含量分別降低了(38.53±2.13)%和(36.97±2.01)%，具有顯著性差異(P<0.05)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無差異(P>0.05)。

3討論

腦血管疾病是由各種病因引起腦血管損傷所導致的一組臨床疾病，其中缺血性腦血管疾病是最常見類型，其發病率、病

殘率和病死率高，并常常伴有學習及認知功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。腦血管疾病常常引起大腦神經功能缺失，而神經細胞凋亡是造成腦神經功能缺失的重要因素，抑制或減少損傷后神經細胞凋亡則是為缺血性腦血管病治療的關鍵〔2〕。c-fos基因是mys家族的一員，編碼核內DNA結合蛋白，調節基因轉錄。正常生理情況下，c-fos基因存在于中樞神經系統，處于低表達或靜止狀態，不易檢測〔1〕。但在腦缺血損傷后，c-fos基因作為即刻早期反應基因迅速作出反應進行表達，其表達產物fos蛋白在生長因子刺激下，促進細胞分裂增殖，但c-fos過度表達時則會誘發細胞凋亡〔6，7〕；缺血還可促使Ca2+大量內流，神經細胞內Ca2+超載，引發神經細胞的損傷或死亡，導致腦神經功能障礙。本研究結果顯示，腦缺血可以誘導神經細胞凋亡，表明TFHL可通過抑制c-fos蛋白過度表達，降低Ca2+超載，減輕神經細胞損傷。

Bcl-2是公認的具有抑制細胞凋亡作用的蛋白，可以抑制Bax從細胞質轉位到線粒體膜，保護線粒體電勢梯度，調節細胞內Ca2+的自穩狀態和氧化還原狀態從而抑制內在凋亡途徑〔8〕。因此，Bcl-2蛋白表達量直接決定神經細胞的存活與凋亡取向。本研究結果顯示，腦組織缺血缺氧，Bcl-2蛋白表達受到抑制，而c-fos過度表達，Ca2+超載，從而加快了神經細胞凋亡。應用山楂葉總黃酮可明顯增加缺血腦組織Bcl-2蛋白的表達，從而抑制或逆轉神經細胞凋亡。因此，TFHL的作用機制可能與其抑制Ca2+超載，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，減少促凋亡蛋白c-fos表達有關，但其減輕腦缺血誘導神經細胞凋亡的具體機制，還需要進一步研究。

參考文獻4

1趙雪花,曾墾.葛根素對大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3和c-fos表達的影響〔J〕.數理醫藥學雜志,2012;25(5):511-2.

2趙雅寧,李建民,張姍姍,等.參芪化瘀膠囊通過PI3-K/Akt信號通路改善大鼠缺血性腦損傷〔J〕.西安交通大學學報醫學版,2011；32(5):636-9.

3李紅,張爽,紀影實,等.山楂葉總黃酮不同給藥途徑對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(3):995-7.

4王基平,孫華,李湘暉,等.脈炎消口服液的含量測定及藥理作用〔J〕.中國醫院藥學雜志,2009;29(2):162-4.

5陳濤,周少華,劉南暖,等.促紅細胞生成素對慢性腦缺血大鼠認知障礙及海馬星形膠質細胞的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(4):1588-90.

6羅國標,劉曉麗,張中菊,等.青藤堿對偏頭痛模型大鼠腦干c-fos、c-jun表達的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志,2013;30(6):513-5.

7顏玲,黃德斌.黃芪多糖對缺血腦損傷大鼠海馬神經遞質及 c-fos mRNA表達的影響〔J〕.中國病理生理學雜志,2012;28(2):263-8.

8郭佳,肖傳實,白瑞,等.脂聯素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響〔J〕.中國藥理學通報,2012;28(7):930-3.

〔2014-08-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：河北省科技廳指令課題(152777890)；河北省教育廳青年基金指令課題(QN201403)；河北省高校省級重點學科資助項目(2013年)；河北省中醫藥抗癡呆重點研究室建設項目資助(2013年)

中圖分類號〔〕R749〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0033-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.014