缺氧預處理對老年大鼠運動性骨骼肌損傷的作用及機制

鄧文騫　王　璐

(成都體育學院運動醫學系，四川　成都　610041)

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缺氧預處理對老年大鼠運動性骨骼肌損傷的作用及機制

鄧文騫王璐

(成都體育學院運動醫學系，四川成都610041)

摘要〔〕目的了解缺氧預處理對老年大鼠運動性骨骼肌損傷發生發展的影響。方法將老年雌性SD大鼠隨機分為對照組(CON)組、大強度離心跑臺運動組(EE)組、缺氧預處理+離心跑臺運動組(HCP)組，4月齡大鼠作為成年對照組(ADU)組。HCP組大鼠進行1 w的缺氧預處理。將EE組及HCP組大鼠進行一次性大強度離心跑臺運動后處死，測定血清白細胞介素(IL)-6含量、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，石蠟切片觀察肌纖維細微結構；取肌肉勻漿測超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。結果EE組及HCP組大鼠運動后均出現骨骼肌損傷現象，EE組損傷較HCP組嚴重。與EE組相比，HCP組血清IL-6、CK及LDH水平明顯降低，比目魚肌MDA水平明顯降低，SOD活性明顯升高。結論缺氧預處理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，降低骨骼肌損傷后炎性反應，對運動性骨骼肌損傷有預防作用。

關鍵詞〔〕運動性骨骼肌損傷;比目魚肌;缺氧預處理;離心運動

第一作者：鄧文騫(1982-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事運動疲勞及運動損傷的防治研究。

運動性肌肉損傷(EIMD)是指機體從事不習慣高強度和或長時間運動后發生的骨骼肌纖維微細損傷〔1〕。導致EIMD的原因之一可能是劇烈運動導致機體的氧化應激反應增加，通過增加機體抗氧化能力能夠減少EIMD的發生〔2〕。而老年人隨著年齡的增加，機體抗氧化能力逐漸下降，發生EIMD的風險也在逐漸增加，如何有效預防EIMD的發生，減少運動鍛煉帶來的負面影響，成為老年運動醫學的研究熱點。近年來的研究發現，預先短暫的缺血或輕度缺氧可激發機體內源性保護機制，對隨后的嚴重缺血、缺氧具有預防和保護作用，其機制可能是缺血/缺氧預處理調動了機體內源性抗損傷機制，使機體對缺血、缺氧損傷發生主動性適應反應〔3,4〕。本研究旨在了解缺氧預處理能否對老年大鼠運動性骨骼肌損傷的發生有預防作用，并對其可能的機制進行初步探討。

1材料與方法

1.1實驗動物與模型60只(22±1)月齡雌性SPF 級SD大鼠，體重(523±38)g，6只4月齡雌性SPF 級SD大鼠，體重(318±24)g，購自四川大學華西醫學中心實驗動物中心，生產許可證編號：SCXK(川)2009-09；使用許可證編號：SYXK(川)2009-045，動物批號：20100801、20120203。4月齡為成年對照組(ADU組)，不進行任何處理。將(22±1)月齡大鼠按體重配對原則隨機分為對照組(CON組)、大強度離心跑臺運動組(EE組)、缺氧預處理+離心跑臺運動組(HCP組)3組，每組20只。適應性喂養1 w后開始將HCP組進行缺氧預處理。根據氮氣稀釋空氣的原理，借用體外循環麻醉中使用的空氣/氧氣混合儀，改裝成空氣/氮氣混合儀，經Datex氣體分析監護儀標定濃度，制成可快速地隨意調節氧氣濃度和氣體流量的供氣系統。調節空氣/氮氣混合器使氧濃度為10%。連續對HCP組大鼠進行7 d的缺氧預處理。具體的處理是每天用10%氧濃度處理大鼠30 min后以空氣復氧5 min，連續處理5次。末次預處理后EE組和HCP組進行一次性大強度下坡跑臺運動，速度19～21 m/min，坡度為-16，運動時間為90 min。運動中如大鼠不能堅持運動，取出休息2 min后繼續，運動時間足90 min。

1.2骨骼肌的取材與處理分別于運動后24、48 h 2個時間點隨機選取各組大鼠10只股靜脈放血處死，離心管收集靜脈血，將血樣離心(4℃,3 000 r/min,10 min)分離血清，測定血清白細胞介素(IL)-6、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量；并迅速取右后肢比目魚肌，于比目魚肌中段切取部分肌肉組織，行多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，HE染色后觀察肌纖維結構變化；取部分肌肉組織,快速稱重，按重量/體積(g/ml)=1∶10加入冰凍生理鹽水，制備勻漿，4℃低溫離心機4 000 r/min離心10 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的檢測。IL-6、CK、LDH、SOD、MDA的酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，采用Thermo Evolution 600紫外-可見分光光度計在450 nm波長比色。組織勻漿總蛋白濃度采用武漢博士德公司BCA蛋白定量試劑盒測定。

1.3統計學處理采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2結果

2.1大鼠骨骼肌HE染色觀察結果對EE組和HCP組大鼠骨骼肌HE染色后進行光鏡觀察。EE組標本在運動后24 h出現炎癥細胞浸潤，出現肌膜模糊，局部肌絲變性，部分出現肌溶解。運動后48 h可見炎癥細胞浸潤嚴重，肌纖維明暗不清晰。HCP組運動后24 h、48 h均存在少量炎癥細胞浸潤，部分核聚集，橫紋模糊。HE染色結果顯示HCP組骨骼肌損傷情況較EE組減輕。

2.2各組大鼠血清IL-6、CK、LDH比較表1可見，在運動后兩個時間點，HCP組IL-6水平均高于CON組而低于EE組(P<0.05)。與CON組相比，EE組和HCP組大鼠運動后各時間點CK、LDH水平升高，其中在運動后48 h差異尤為顯著(P<0.01)。HCP組在運動后各時相血清CK、LDH濃度較EE組相比均有降低(P<0.05)。

2.3各組大鼠骨骼肌勻漿SOD、MDA水平比較在運動后24 h及48 h，HCP組MDA水平較CON組升高而較EE組降低(P<0.05)，EE組MDA水平在運動后各時相均高于CON組(P<0.05)。EE組肌肉組織SOD活性在運動后兩個時間點均顯著低于CON組和HCP組(P<0.05)，CON組和HCP組之間的SOD活性無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血清IL-6、CK、LDH比較

與同時點CON組比較：1)P<0.01；與同時點EE組比較：2)P<0.05

表2　各組大鼠骨骼肌勻漿SOD、MDA水平比較

與同時點CON組比較：1)P<0.05；與同時點EE組比較：2)P<0.05；與同時點HCP組比較：3)P<0.05

3討論

自由基代謝紊亂導致氧化應激失調是EIMD機制研究的一個熱點。人體內的自由基以氧自由基為主，內源性抗氧化酶如SOD可清除氧自由基，從而保護細胞免受損傷。當機體受到異常刺激導致抗氧化體系能力減弱時，大量未及時清除的氧自由基可攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化反應,導致脂質過氧化物如MDA的產生。因此，SOD活性降低和MDA水平升高，可表明氧自由基的大量生成以及生物膜遭到破壞。研究發現正常情況下老年人骨骼肌SOD活性和MDA水平會隨著年齡的增加而發生變化，導致機體抗氧化能力下降〔5〕，單純運動和衰老都能使活性氧增多，引起氧化應激〔6〕，那么老年人運動勢必會導致更為強烈的氧化應激。本研究結果說明老年大鼠骨骼肌損傷時機體抗氧化能力會進一步下降，而這可能是老年人容易發生運動性骨骼肌損傷且恢復較慢的原因之一。

前期的缺血/缺氧預處理可激發機體內源性抗氧化能力從而對隨后到來的嚴重缺血、缺氧產生預防和保護作用。Saxena等〔7〕對大鼠采用氯化鈷進行低氧處理研究發現缺氧預處理的骨骼肌運動能力和抗氧化損傷能力明顯提升，同時也發現這種形式的低氧預處理能增強骨骼肌線粒體生成和有氧呼吸能力。本研究表明缺氧預處理能有效預防這種運動所致的骨骼肌損傷，前期的低氧刺激激發了機體防御系統，大大提高了其抗氧化能力，從而對抗離心運動導致的自由基增加所帶來的損傷。MDA作為脂質過氧化的代表產物，是衡量機體自由基反應強度的敏感指標〔8〕。本研究說明低氧預刺激能夠有效控制大強度離心運動造成的自由基增加，對生物膜存在保護作用從而減少肌纖維的損傷。

然而，本研究發現缺氧預處理并未完全阻止骨骼肌損傷的發生，提示氧化應激可能僅是EIMD產生的原因之一。有研究報道通過服用外源性抗氧化劑，能對運動性肌肉損傷產生一定的保護作用〔9～12〕，通過長期的有氧鍛煉也能提高衰老大鼠骨骼肌的抗氧化能力〔13〕。因此,預處理與其他預防措施如按摩、藥物、物理治療等有無聯合作用值得深入探討，而低氧預處理是否在老年人體上對運動性骨骼肌損傷的發生具有同樣的保護作用也有待于進一步研究。

綜上所述,本研究顯示，缺氧預處理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，對大強度下坡跑臺運動所致的老年大鼠運動性骨骼肌損傷有預防作用。

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〔2014-05-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：國家體育總局重點研究領域項目(2014B014)；國家體育總局運動醫學重點實驗室資助項目(2013CTYY02)；四川省教育廳資助科研項目(12ZB014)；四川省高?？蒲袆撔聢F隊專項基金資助項目(KYTD201011)

中圖分類號〔〕R319；R873〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0005-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.002