沙門柏干酪青霉多糖提取工藝優(yōu)化及其抗凍傷活性研究

劉 冬 葉紅玲 李 萍 譚 煒

(1. 安慶職業(yè)技術學院，安徽 安慶 246003；2. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051)

沙門柏干酪青霉多糖提取工藝優(yōu)化及其抗凍傷活性研究

劉 冬1葉紅玲1李 萍1譚 煒2

(1. 安慶職業(yè)技術學院，安徽 安慶 246003；2. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051)

利用單因素和Box-Behnken試驗對沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖提取工藝(水料比、提取溫度和提取時間)進行優(yōu)化，并評價胞內(nèi)多糖的抗凍傷活性。結果表明：最適水料比、提取溫度和提取時間分別為36.7∶1(mL/g)、89.6 ℃和123 min，在該條件下多糖得率約為12%。另外，胞內(nèi)多糖抗凍傷活性與甘油相當，1%～2%的多糖可顯著提高短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的存活率。

沙門柏干酪青霉；多糖；提取條件；冷凍保護劑

沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)是Camembert 干酪的主要成熟劑，它生長在 Camembert干酪的表面，呈白色[1]。在干酪成熟過程中，沙門柏干酪青霉分泌大量的脂肪酶和蛋白水解酶促進干酪的成熟，并形成Camembert干酪典型的風味和特有的組織結構[2]。目前，關于P.Camemberti的研究主要集中在其對干酪品質(zhì)的影響[3-4]以及Camembert干酪成熟過程中不同成熟劑菌群間的協(xié)同作用等方面[5-6]。此外，研究人員[7]發(fā)現(xiàn)P.Camemberti可分泌右旋磷霉素，并具有抑制病原菌的作用；Bizet 等[8]對P.Camemberti菌絲營養(yǎng)成分進行分析，發(fā)現(xiàn)其富含糖類、脂類、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，其中糖類總含量為33.3%。目前，關于P.Camemberti胞內(nèi)多糖提取條件優(yōu)化的研究，未見報道。本研究擬以沙門柏干酪青霉菌絲體為材料，采用單因素和Box-Behnken試驗對胞內(nèi)多糖提取工藝進行優(yōu)化，并評價沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖對冷凍干燥處理過程中雙歧桿菌的保護作用，旨在提高沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖的提取率，并為該多糖在益生菌冷凍保護劑領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)：美國Mad Millie公司；

短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve1.2213)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis1.1853)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum1.1852)：哈爾濱美華生物技術股份有限公司；

液氮：安慶市華興化工氣體有限公司；

牛肉浸膏、酵母膏、大豆蛋白、蛋白胨：生化試劑；

葡萄糖、95%乙醇、濃硫酸和苯酚等其他化學試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

分析天平：ATX224型，島津儀器(蘇州)有限公司；

紫外可見分光光度計：752型，上海光學儀器有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：311型，美國Thermo公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州國勝電器有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2FD型，上海博訊儀器公司；

冷凍干燥機：FD-1B-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

高速冷凍離心機：ST40R型，美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙門柏干酪青霉菌絲的制備 在液體PDA培養(yǎng)基中接種3～5塊沙門柏干酪青霉菌碟，于28 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)72 h。過濾得菌絲球，去除瓊脂塊，以蒸餾水洗滌3～5遍后，在50 ℃下干燥至恒重得菌絲體備用。

1.2.2 胞內(nèi)多糖提取工藝 取菌絲(m)置于研缽中，倒入適量液氮研碎。按水料比例30∶1(mL/g)添加70 ℃的熱水并將菌絲全部轉(zhuǎn)到燒杯中，將燒杯置于70 ℃水浴鍋中保溫90 min。冷卻至室溫，過濾得濾液(V0)，然后加入3倍體積的乙醇(95%)于6 ℃冷藏12 h。在6 ℃，10 000 r/min條件離心10 min，收集多糖沉淀，用適量蒸餾水(V)復溶[9]。

1.2.3 多糖含量測定及得率計算 采用苯酚—硫酸法[10]制作多糖測定標準曲線。取濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL分別加入25 mL比色管中，補蒸餾水至1 mL，以1 mL蒸餾水作空白對照。分別依次加入6%苯酚1 mL，濃硫酸5 mL，室溫靜置30 min。于490 nm下，測定吸光度值(A)，試驗重復3次，取平均值。以葡萄糖濃度為X軸，A值為Y軸繪制標準曲線，得標準曲線方程：A=1.023 1C-0.007 2，R2=0.999 2。將多糖稀釋適當倍數(shù)(n)，取1 mL樣品參考標準曲線制作方法測得吸光度值，代入方程(1)得多糖濃度。

(1)

式中：

P——多糖得率，%；

n——多糖稀釋倍數(shù)；

C——多糖濃度，mg/mL；

V——多糖溶液體積，mL；

m——菌絲質(zhì)量，g；

1 000——質(zhì)量單位換算系數(shù)。

1.2.4 單因素試驗

(1) 水料比的選擇：固定提取溫度為70 ℃，提取時間為90 min，稱取菌絲置于研缽中，倒入液氮，研碎。分別以10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1(mL/g)的水料比，參考“1.2.2胞內(nèi)多糖提取工藝”步驟提取胞內(nèi)多糖。按照“1.2.3多糖含量測定及得率計算”方法獲得不同水料比條件下的多糖得率。

(2) 提取溫度的選擇：固定提取時間為90 min，水料比為40∶1(mL/g)，稱取菌絲置于研缽中，倒入液氮研碎。分別以60，70，80，90，100 ℃的水，參考“1.2.2胞內(nèi)多糖提取工藝”步驟提取胞內(nèi)多糖。按照“1.2.3多糖含量測定及得率計算”方法獲得不同提取溫度下的多糖得率。

(3) 提取時間的選擇：固定水料比為40∶1(mL/g)，提取溫度為90 ℃，稱取菌絲置于研缽中，倒入液氮，研碎。分別提取30，60，90，120，150 min，參考“1.2.2胞內(nèi)多糖提取工藝”步驟提取胞內(nèi)多糖。按照“1.2.3多糖含量測定及得率計算”方法獲得不同提取時間條件下的多糖得率。

1.2.5 Box-Behnken試驗 在單因素試驗結果的基礎上利用Design expert 10設計Box-Behnken試驗，并在最優(yōu)條件下進行驗證，試驗重復3次。

1.2.6 雙歧桿菌冷凍試驗 按2 g/L的接種量將短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌冷凍菌粉分別接于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將雙歧桿菌培養(yǎng)物移至50 mL滅菌離心管中，于10 000 r/min 6 ℃下離心10 min，用適量無菌水洗滌3次，分別用5 mL不同質(zhì)量分數(shù)的甘油和多糖溶液復溶雙歧桿菌菌體，置于-80 ℃下預凍3 h，然后置于真空冷凍干燥機中在-50 ℃，-20 Pa下干燥12 h，得雙歧桿菌菌粉備用。

1.2.7 雙歧桿菌計數(shù)及活菌存活率計算 雙歧桿菌活菌計數(shù)參考Ye等[11]報道的方法進行，取冷凍前后的雙歧桿菌進行10倍稀釋，分別接種于含0.05% LiCl的固體MRS培養(yǎng)基上，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h計數(shù)，試驗重復3次，每個重復設3個平行。雙歧桿菌存活率按式(2)計算：

(2)

式中：

S——雙歧桿菌存活率，%；

N1——冷凍前液體菌懸液中雙歧桿菌活菌數(shù)；

N2——冷凍后菌粉中雙歧桿菌活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 水料比對多糖得率的影響

由圖1可知，水料比在10∶1～40∶1(mL/g)時，多糖得率與水料比成正相關關系，當水料比大于40∶1(mL/g)時多糖得率呈下降趨勢。即適宜的水料比在30∶1～40∶1 (mL/g)范圍內(nèi)，此時多糖得率在8.0%～8.1%。

2.2 提取溫度對多糖得率的影響

由圖2可知，當提取溫度在60～90 ℃時，多糖得率隨提取溫度升高而增加，并在90 ℃達到最大值10.23%。當提取溫度大于90 ℃時，多糖得率與溫度的增加呈負相關關系，類似的現(xiàn)象在Zhu[12]和Ma[13]等的報道中也被觀察到。

圖1 水料比對多糖得率的影響

圖2 提取溫度對多糖得率的影響

2.3 提取時間對多糖得率的影響

提取時間是影響多糖提取得率的重要因素，因為提取液滲透到干物料中以及多糖被浸提出來并擴散到提取液中均需充足的時間[12]。由圖3可知，在30～120 min時，多糖得率與提取時間的增加呈正相關性，而后隨著提取時間的增加多糖得率基本保持穩(wěn)定。即適宜的提取時間為120 min，此時多糖得率為10.2%。此外，水料比、提取溫度和提取時間之間往往存在交互作用[14-15]，且為獲得多糖的最佳提取參數(shù)，在單因素結果的基礎上用Box-Behnken試驗進一步優(yōu)化提取條件。

2.4 Box-Behnken試驗

圖3 提取時間對多糖得率的影響

表1 因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計與試驗結果

表3 二次多項式模型回歸系數(shù)估計和試驗結果方差分析?

Table 3 Estimated regression coefcients for the quadratic polynomial model and the analysis of variance for the experimental results

模型參數(shù)系數(shù)估計標準誤差平方和F值P值模型--32.6658.46<0.0001常數(shù)項12.060.11---A0.670.0883.6558.720.0001B0.210.0880.365.820.0466C0.610.0883.0048.350.0002AB-0.0750.120.0230.360.5661AC-0.730.122.1033.870.0007BC-0.450.120.8113.050.0086A2-1.960.1216.09259.30<0.0001B2-0.680.121.9531.370.0008C2-0.830.122.9046.730.0002失擬項--0.0820.310.8167誤差--0.35

?R2=0.987，AdjR2=0.97，PredR2=0.944，CV=2.39%。

選擇水料比、提取溫度和提取時間為變量，并確定它們的水平(見表1)。按表2所列組合進行試驗，試驗結果見表2。利用Design expert 10.0進行分析，結果見表3。水料比、提取溫度和提取時間均對多糖得率有顯著影響，且影響程度從大到小依次為水料比>提取溫度>提取時間。另外，水料比與提取溫度的交互項、提取溫度與提取時間的交互項以及三因素的平方項也對多糖得率有顯著影響。回歸方程為：

Y=12.06+0.67A+0.21B+0.61C-0.075AB-0.73AC-0.45BC-1.96A2-0.68B2-0.83C2。

(3)

模型的方差分析結果見表3，方程(3)的Pmodel<0.000 1、Plose=0.816 7>0.05、R2=0.987、AdjR2=0.970、PredR2=0.944，CV(變異系數(shù))=2.39%<5%。這些表明方程(3)顯著、無失擬因素存在，能較好地反應所達三因素與多糖得率之間的真實關系[13]，而且具有良好的重現(xiàn)性[14]。由方程(3)任選A、B和C中的2因素為變量另一因素固定為“0水平”點，作圖。多糖得率隨水料比、提取溫度和提取時間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且方程(3)存在最大值點(圖4～6)。由方程(3)得多糖得率預測最大值為12.2%，此時水料比、提取溫度和提取時間分別為36.72∶1(mL/g)、89.59 ℃和122.88 min。為方便驗證試驗的進行，選擇在水料比為36.7∶1(mL/g)，提取溫度為89.6 ℃和提取時間為123 min條件下，進行驗證實驗得多糖得率為12.1%，預測值和試驗結果基本一致，進一步確認了模型預測的準確性，即在最優(yōu)條件下可以得到較高的提取率。

圖4 水料比和提取時間交互作用響應面和等高線圖

圖5 水料比和提取溫度交互作用響應面和等高線圖

圖6 提取時間和提取溫度交互作用響應面和等高線圖

2.5 多糖對冷凍干燥雙歧桿菌的保護作用

冷凍干燥是益生菌菌粉生產(chǎn)的關鍵步驟，然而冷凍和干燥過程均會對益生菌造成損傷，致使益生菌存活率明顯下降[15-16]。為保證益生菌的活力在冷凍干燥過程中使用保護劑提高益生菌的存活率。保護劑按照化學結構分為11類，常用的保護劑為糖類和醇類，如羥乙基淀粉和甘油[15]。多糖也可作為冷凍保護劑減少冷凍干燥對細胞的損傷[15]，沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖對冷凍干燥雙歧桿菌存活率的影響見表4。未添加保護劑的雙歧桿菌存活率在3.28%～3.60%時，結果顯示冷凍干燥對雙歧桿菌造成了較大的損傷。以甘油作為保護劑可顯著提高雙歧桿菌的存活率，這與李德斌等[16]的報道一致。與空白相比，質(zhì)量分數(shù)為1%～2%的多糖可顯著提高短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的存活率，最高存活率分別達31.27%，30.40%，30.66%。另外，添加相同濃度的甘油和多糖的雙歧桿菌存活率基本一致，表明等質(zhì)量分數(shù)的甘油和多糖對3種雙歧桿菌的保護作用相當。即沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖可作為雙歧桿菌冷凍干燥保護劑的潛在選項。

表4 多糖對冷凍干燥過程中雙歧桿菌存活率的影響?

? *表示處理組與空白組相比雙歧桿菌存活率在P<0.01下存在顯著差異。

3 結論

利用單因素和Box-Behnken試驗對沙門柏干酪青霉胞內(nèi)多糖提取工藝進行優(yōu)化，得最適水料比、提取溫度和時間分別為36.7∶1(mL/g)、89.6 ℃和123 min，在此條件下多糖得率為12.1%。該胞內(nèi)多糖可降低冷凍干燥處理對雙歧桿菌造成的損傷，顯著提高雙歧桿菌的存活率，其效果與等濃度的甘油相當。然而，起抗凍傷作用的胞內(nèi)多糖具體組分及其抗凍傷機理尚需進一步研究。

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Optimization for the extraction of polysaccharides fromPenicilliumcamembertiand its antifreeze activity

LIU Dong1YEHong-ling1LIPing1TANWei2

(1.AnqingVocationalTechnicalCollege,Anqing,Anhui, 246003,China;2.AnhuiProvincialFoodandDrugInspectionandResearchInstitute,Hefei,Anhui, 230051,China)

In this paper, the single-factor and Box-Behnken experiments were employed to optimize the extraction parameters of intracellular polysaccharide (IPS) fromPenicilliumcamemberti, i.e. liquid-solid ratio, extraction time and temperature, and the antifreeze activity of IPS was also evaluated. The results showed that the IPS could be best extracted with liquid-solid ratio 36.7∶1 (mL/g) at 89.6 ℃ for 123 min, and the yield of it was about 12%. In addition, the antifreeze activity of IPS was almost equal to glycerol, and the livabilities ofBifidobacteriumbreve,Bifidobacteriuminfantis,Bifidobacteriumbifidumwere significantly improved by 1%～2% IPS.

Penicilliumcamemberti; polysaccharide; extraction condition; cryoprotectants

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.039

安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(編號：KJ2014A148)；安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(編號：KJ2015A368)；安徽省教育振興計劃重大教學改革研究項目(編號：2015zdjy181)；安徽省教質(zhì)量工程項目(編號：2015jtxx157)；教育部高職教育創(chuàng)新發(fā)展行動計劃項目(編號：XM-16)

劉冬(1982—)，男，安慶職業(yè)技術學院講師，博士。 E-mail:liudong1595693@163.com

2016—10—08