葡萄酒中乙醛氣相—質譜測定方法的建立

WEI Xiao-qun -,3 ,3 -,3

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學，廣東 廣州 510642；2. 廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；3. 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

葡萄酒中乙醛氣相—質譜測定方法的建立

WEI Xiao-qun1,2,3ZHENGXuan2GUOQing-yuan2,3LINGLi2,3ZENGGuang-feng2,3HUANGJin2CAIChun2

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學，廣東 廣州 510642；2. 廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；3. 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

建立氣相色譜—質譜測定葡萄酒中乙醛含量的方法，并考察提取溶劑、解析pH、衍生化實際用量等因素對定量結果的影響。結果表明：該方法檢測限為0.12 mg/kg，線性范圍為0.2～100.0 mg/kg(R2=0.999 4)，樣品三水平加標回收率為89.3%～113.0%，平均相對標準偏差為1.28%～9.42%(n=6)，適用于葡萄酒中乙醛總量的測定。

乙醛；葡萄酒；氣相色譜—質譜

葡萄酒中醛類物質是重要的風味物質，其中乙醛占據(jù)了90%[1]。葡萄酒中低含量的乙醛具有一種愉快的水果香氣，但濃度較高時，會產(chǎn)生一種青草或類似青蘋果的異味[2]。乙醛對微生物的生長既有促進作用也會產(chǎn)生抑制作用，主要取決于其濃度的大小，可見乙醛對于葡萄酒具有重要意義。但同時醛類化合物對人體健康有潛在的危害，甲醛、乙醛已被國際癌癥研究機構(IARCL995)確定為可能會引起致癌的 2B(Group 2B)類物質[3]，但美國食品和藥物管理局(FDA)將乙醛歸為“一般認為安全(generally regard as safe)類物質，且目前歐盟也將乙醛列為合法的食品風味添加劑。國內外目前尚無葡萄酒中乙醛的限量標準。

在葡萄酒中，乙醛以結合態(tài)和游離態(tài)形式存在，目前中國關于葡萄酒中乙醛測定方法有多種。化學法即碘量滴定法用于測定總醛，實測總量高于乙醛含量；酶法(乙醛脫氫酶法)測定受某些金屬離子影響；氣質聯(lián)用法和頂空氣相色譜法主要用于黃酒或葡萄酒中游離態(tài)乙醛含量的檢測[4-5]；高效液相色譜法主要用于乙醛總量的測定，但該法容易受基質干擾[6-9]。應用衍生化法可以有效提取游離態(tài)和結合態(tài)乙醛，而且氣相色譜質譜法能夠排除基質干擾，因而本研究擬采用衍生化—氣相色譜—質譜法對葡萄酒中乙醛的含量進行測定，以期更好解決乙醛總量測定和基質干擾的問題，建立適用于釀酒行業(yè)中乙醛含量的檢測和鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

氣相色譜/質譜聯(lián)用儀(帶EI源)：Agilent7890A-5975C型，美國Agilent科技公司；

渦旋混合器：MS3 basic型，德國IKA集團。

1.1.2 試驗材料

5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液(C6H6N4O4，簡稱DNPH，CAS：119-26-6)：準確稱取0.5 g(精確到0.001 g)2,4-二硝基苯肼(色譜純)，加入30 mL鹽酸(優(yōu)級純)和30 mL乙腈(色譜純)溶解，然后轉移到100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；

12%的乙醇溶液：量取12 mL無水乙醇(色譜純)于100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度線；

4 mol/L的氫氧化鈉溶液：準確稱取8 g氫氧化鈉(精確到0.001 g，分析純)于燒杯中，加入40 mL水溶解，轉移到50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度線；

25%的硫酸溶液：準確量取12.5 mL濃硫酸(優(yōu)級純)于已有35 mL水的燒杯中，冷卻后轉移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度線。

乙醛標準儲備液：1 000 mg/L乙醛(溶劑為甲醇)，該溶液應在-18 ℃冰箱中保存。

樣品：市售紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡葡萄酒。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品測定 用移液管準確量取0.50 mL葡萄酒樣品，于15 mL離心管中(起泡酒需預先脫氣)，加入0.20 mL 4 mol/L 的氫氧化鈉溶液，室溫下靜置20 min。然后加入0.2 mL 25%的硫酸溶液和0.5 mL 5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液，室溫避光衍生6 h。衍生結束后，加入5 mL環(huán)己烷，渦旋提取2 min，4 500 r/min離心5 min。下層溶液用5 mL環(huán)己烷重復提取1次。合并2次提取液用環(huán)己烷定容至10 mL，過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，供上機分析。

脫氣：將樣品酒樣約300 mL倒入1 000 mL錐形瓶中，蓋塞(橡皮塞)，在室溫條件下，輕輕搖動、開塞放氣(開始有“砰砰”聲)，蓋塞。反復操作，直至無氣體逸出為止。

1.2.2 乙醛2,4-二硝基苯腙標準工作溶液的制備 分別量取0.50 mL標準工作液于15 mL離心管中，然后加入0.5 mL 5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液，室溫避光衍生6 h。衍生結束后，加入5 mL環(huán)己烷，渦旋提取2 min，4 500 r/min離心5 min。下層溶液用5 mL環(huán)己烷重復提取1次。合并2次提取液用環(huán)己烷定容至10 mL，過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，供上機分析。

1.3 儀器條件

1.3.1 氣相色譜條件 色譜柱：DB-5ms毛細管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)或性能類似的分析柱。程序升溫：初始溫度130 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持3 min。進樣口溫度：280 ℃。接口溫度：280 ℃。載氣：He(純度>99.999%)，1.2 mL/min，恒流。進樣量：1 μL。進樣方式：不分流進樣。

1.3.2 質譜條件 離子源溫度：230 ℃。四極桿溫度：150 ℃。電離方式：EI。溶劑延遲：8 min。質譜掃描方式：選擇離子采集模式(SIM)。選擇監(jiān)測離子(SIM)：定量離子m/z224，定性離子m/z79，122，152。保留時間，第一個乙醛衍生物的保留時間為(11.386±0.200) min，第二個乙醛衍生物的保留時間為(11.626±0.200) min。

2 結果與討論

2.1 衍生產(chǎn)物

乙醛和2,4-二硝基苯肼反應，生成乙醛-2,4-二硝基苯腙。由于反應產(chǎn)物具有異構體，在毛細管氣相色譜柱中的色譜行為呈現(xiàn)雙峰(見圖1)，離子碎片完全相同。異構體在標準品以及紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡酒中的峰面積比例見表1。由表1可知，在不同食品基質中這兩種異構體的比例是不變的，因而可采取單峰定量法，也可采用雙峰定量法。反應產(chǎn)物存在順反異構[10]。

圖1 乙醛和2,4-二硝基苯肼反應產(chǎn)物色譜質譜圖

Figure 1 Acetaldehyde and 2,4-dinitrophenylhydrazine reaction chromatography mass spectra

表1 兩種異構體在標液以及紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡酒中的峰面積比例

Table 1 The peak area ratio of the two isomers in the standard solution,red wine, white wine and sparkling wine %

樣品峰1面積峰2面積標液 39.0460.96紅葡萄酒39.4560.55白葡萄酒39.1660.84起泡酒 39.2360.77

2.2 影響因素

2.2.1 提取溶劑的影響 試驗比較了環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、異辛烷、乙醚對衍生物乙醛-2，4-二硝基苯棕的萃取效果，結果(見圖2)表明使用環(huán)己烷作為萃取劑效果最好。故該方法確定提取溶劑為環(huán)己烷。

2.2.2 前處理pH的影響 在pH低于3.5時乙醛與葡萄酒中的SO2容易結合生成結合態(tài)的乙醛—二氧化硫加合物，該物質在堿性環(huán)境時轉化為游離態(tài)的乙醛和SO2。試驗考察了強堿性條件(即pH為10～14)解離20 min對乙醛衍生化效率的影響，結果見圖3。由圖3可知，當pH為10和11時，獲得的衍生化產(chǎn)物峰面積相對較低；當pH在12～14時，添加等溶度乙醛可獲得較高且接近的衍生物峰面積，說明在該pH范圍內衍生化效率并無顯著變化，因而選擇13作為前處理pH。

圖2 溶劑對衍生物提取效果的影響

圖3 解離pH對乙醛衍生化效率的影響

2.2.3 前處理時間的影響 堿性環(huán)境下，結合態(tài)乙醛釋放出來需要一定的時間，對于結合態(tài)乙醛含量較高的酒樣，解離時間太短會造成解離不充分，影響測定結果。試驗選取解離時間分別為5，10，20，30，40 min，結果(見圖4)表明，解離時間為20 min時所得的產(chǎn)物響應值最高。

圖4 前處理時間對乙醛衍生化效率的影響

Figure 4 Effect of different pretreatment time on the efficiency of acetaldehyde derivatives

2.2.4 衍生劑用量的影響 分別使用0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，濃度為5 g/L的2,4-二硝基苯肼溶液對衍生化效率的影響，結果(見圖5)顯示，隨著衍生化實際使用量的升高，衍生化效率越高，當衍生化試劑超過0.5 mL后，衍生化效率趨于平穩(wěn)，說明在該試驗條件下衍生試劑最佳用量為0.5 mL。的定量差異，結果發(fā)現(xiàn)用標準加入法測定的結果扣除本底后與標準曲線測定結果差別不大。這是因為該方法稀釋倍數(shù)較大，稀釋后基質影響可忽略。因此，在確定方法檢出限時，可使用標準溶液逐級稀釋，以3倍信噪比(S/N=3)對應的濃度乘以稀釋倍數(shù)換算為方法的檢出限。

圖5 衍生試劑用量對衍生化效率的影響

Figure 5 Influence of the amount of derivatization reagent on the efficiency of acetaldehyde derivatives

表2 紅葡萄酒基質加標與空白加標測定對比

表3 白葡萄酒基質加標與空白加標測定對比

2.3 方法的線性范圍和回收率

該方法的檢出限采用試劑空白添加標準溶液逐級稀釋進行測定得到，以3倍信噪比(S/N=3)對應的濃度確定為方法的檢出限，因而該方法葡萄酒中乙醛的檢出限為0.06 mg/L。

該方法的稀釋倍數(shù)為20倍，方法測定的線性范圍為：0.2～100.0 mg/L，線性相關系數(shù)為0.999 4，校準曲線方程為y=7.194×104x+2.929×103。

該方法通過在樣品基質中加標的方法測定回收率的方法來驗證方法的正確度。因為無法找到空白基質，且樣品中乙醛含量不一，故在3種葡萄酒基質加標回收時選擇了約10%～20%常見含量、常見含量、2倍常見含量和5倍常見含量進行回收率試驗，加標時每個水平重復進行6次平行單獨測定，結果表明方法的總體平均回收率為89.3%～113.0%，方法的相對標準偏差為 1.28%～9.42%，能夠滿足日常檢測需要。

2.4 實際樣品的測定

使用該方法對通過進口法檢委托的27個葡萄酒樣品進行了檢測，檢測結果見表4。由表4可知，不同類型的葡萄酒中乙醛的本底差別較大，其中葡萄酒中乙醛的含量在1～3 mg/kg，白葡萄酒和起泡葡萄酒的含量在20 mg/kg以上，當檢測結果超過檢測限時需要增大稀釋倍數(shù)，使之落在線性范圍之內。

3 結論

該研究建立了氣相色譜—質譜測定葡萄酒中乙醛含量的方法，研究了兩個衍生化產(chǎn)物、提取溶劑、解析pH、衍生化實際用量等因素對定量結果的影響。結果表明，該方法檢測限為0.12 mg/kg，線性范圍為0.2～100.0 mg/kg，r2=0.999 4，樣品加標回收率為89.3%～113.0%，平均相對標準偏差為1.28%～9.42%(n=6)，適用于紅葡萄酒、白葡萄酒、起泡葡萄酒中乙醛含量的測定，該方法可用于其它酒類中乙醛含量的測定。本研究的不足之處在于操作略嫌繁瑣。

表4 葡萄酒樣品的測定結果與信息

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Determination of acetaldehyde in wine by gas chromatography-mass spectrometry

韋曉群1,2,3鄭 璇2郭慶園2,3凌 莉2,3曾廣豐2,3黃 瑾2蔡 純2

(1.SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China; 2.GuangdongInspectionandQuarantineTechnologyCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China; 3.GuangdongKeyLaboratoryofImportandExportTechnicalMeasuresofAnimal,PlantandFood,Guangzhou,Guangdong510623,China)

A method for determination of acetaldehyde in wine by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was established, in which the influence factor on the detected results were studied, such as extraction agent, desorption pH, derivatization reagents. As a result, the limit of determination (LOD) of vanillin and ethyl-vanillin was 0.12 mg/kg. linearity range was 0.2～100.0 mg/kg(R2=0.999 4), The spiked recovery was between 89.3%～113.0%, and the RSD ranged from 1.28%～9.42%(n=6). This method was applicable for determination of acetaldehyde in wine.

acetaldehyde; wine; GC—MS

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.016

國家質檢總局科技項目(編號：2015IK065)

韋曉群(1979-)，男，華南農(nóng)業(yè)大學副研究員，博士。 E-mail:weixq@iqtc.cn

2016—08—20