桑葚果酒分批發酵動力學研究

胡永正 李明元 李 梅 丁文武 康 玲 王 沖 陳建樺 李春梅

(西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039)

桑葚果酒分批發酵動力學研究

胡永正 李明元 李 梅 丁文武 康 玲 王 沖 陳建樺 李春梅

(西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039)

以桑葚汁為原料，探討果酒發酵過程中菌體生長、產物生成和底物消耗變化規律，利用Logistic模型方程擬合菌體生長、產物生成、基質消耗曲線，建立發酵動力學模型。結果表明，當發酵液初始含糖量為200 g/L時，接種5%活化酵母，28 ℃發酵100 h后，殘糖含量降為3.86 g/L，酵母數量增長為2.83×108CFU/mL，乙醇含量達到9.01%，菌體生長、產物生成、基質消耗的動力學模型擬合度良好，模型R2分別為0.974，0.988，0.991，模型能較好地反映和預測桑葚果酒發酵變化的過程。

桑葚；果酒；發酵；動力學

桑葚是多年生桑科落葉喬木桑(MorusalbaL.)的成熟果實，桑葚富含糖分、有機酸、游離氨基酸、維生素、花青素、礦物質及微量元素[1]，具有較強的抗氧化活性[2]，已被國家衛生計生委列入“既是食品又是藥品的物品名單”[3]，由于其營養豐富且具有一定保健功能，已成為研究熱點。目前桑葚已被開發成不同產品，如桑葚汁飲料、桑葚果醋[4]、桑葚酒等[5]。而在桑葚酒的研究中，主要集中于酵母篩選[6]、釀造工藝、物質變化[7]和品質研究[8]等方面，鮮見桑葚果酒釀造動力學模型的相關研究。

發酵過程中環境因素對菌體生長速率、基質消耗速率和產物生成速率有極大影響，發酵動力學則是通過菌體生長、基質消耗、產物生成的動態平衡探究其內在規律[9]，通過發酵動力學，可以達到對最佳發酵工藝條件的控制，預先估判早期出現的異常情況，同時為分批發酵過渡到連續發酵、發酵放大提供理論依據[10]。

關于模擬發酵過程的模型有多種，GüLNUR B等[11]總結了發酵動力學中常用的符合菌體生長變化、產物生成變化、底物消耗變化的10余種發酵動力學模型方程，包括Monod方程、Moser方程、Teissier方程等；鄭啟富等[12]提出一種基于徑向基函數網絡和最小片而成回歸技術的發酵動力學建模方法。另外，Logistic方程是典型“S”型曲線，被廣泛地作為發酵過程中酵母的生長變化模型[13]，本試驗擬針對桑葚酒釀造過程，通過探究菌體生長數、殘糖消耗量、乙醇生成量的變化情況研究桑葚果酒釀造過程中的發酵動力學，建立數學模型并求解相關參數，為桑葚酒釀造過程中的跟蹤控制和放大生產提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚：大十桑葚，購于四川南部縣；

酵母：安琪果酒酵母SY，安琪酵母股份有限公司；

正丁醇：色譜純，美國sigma公司；

葡萄糖、3-5二硝基水楊酸：分析純，成都市科隆化工試劑廠；

氣相色譜儀：GC2020型，上海析默分析儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2600型，美國UNICO公司；

血球板計數器：25×16型，上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

桑葚→榨汁→過濾→添加蔗糖→添加二氧化硫→添加活化后釀酒酵母→恒溫發酵→陳釀→澄清→調酒→成品

1.2.2 研究方法 在陳祖滿[14]和Wang C Y等[15]對桑葚酒工藝研究的基礎上，對桑葚釀造工藝進行預試驗后確定最佳工藝，量取250 mL桑葚汁滅菌并調整成分，將活化的酵母按照5%的添加量加入到桑葚汁中，于28 ℃下恒溫培養100 h，每隔4 h取樣，測定26次取樣的樣品中酵母數量、殘糖含量及乙醇體積分數。

1.2.3 檢測方法

(1) 酵母數量：采用血球板計數法。將發酵液稀釋一定倍數后用0.1%呂氏堿性美蘭染液染色，然后滴于25×16的血球板計數器上，利用16×40倍顯微鏡進行酵母計數。

(2) 殘糖含量：3-5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法。根據王春曉[16]的方法進行簡化改進：準確稱量干燥至恒重的葡萄糖100 mg定容至100 mL，作為1.0 mg/mL的標注貯備液；取3,5-二硝基水楊酸6.3 g及2 mol/L 氫氧化鈉溶液262 mL加到364 g/L的酒石酸鉀鈉溶液中，再各加5 g結晶酚和5 g亞硫酸氫鈉溶解，定容至1 000 mL后貯藏于棕色瓶；標準曲線制作步驟見表1。測定樣品時，吸取1.0 mL樣品溶液，加入1.0 mL蒸餾水和1.5 mL DNS溶液，混合均勻后沸水中加熱5 min后冷卻，再加入21.5 mL蒸餾水，搖勻后在540 nm處測定吸光值，根據標準曲線查詢樣品葡萄糖含量。

表1 葡萄糖標準曲線操作步驟?

? 將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5 mL蒸餾水，搖勻后，在540 nm處測定吸光值。

樣品中糖含量計算：

(1)

式中：

S——樣品糖含量；g/L；

m——根據吸光值查找標曲所得糖含量，mg；

v——吸取樣品液的體積，mL；

n——稀釋倍數。

(3) 乙醇體積分數：氣相色譜法。參照GB/T 15038—2006進行改進：以正丁醇作為內標物質，標準樣品和待測樣品按體積分數2%添加正丁醇作內標。色譜條件：色譜柱：WOD-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min上升至180 ℃，保持1 min，檢測器溫度250 ℃，18 min；進樣器210 ℃，平衡時間3 min；氫氣流量：35 mL/min，空氣流量：387 mL/min。

1.3 動力學發酵模型

1.3.1 菌體生長動力學模型 前人利用Logistic方程分別對蜂蜜釀酒[17]、甘蔗釀酒[18]進行動力學研究，均得出較好的擬合效果，根據本試驗數據統計結果可以看出，菌體數量呈“S”型，因此可將Logistic模型應用于桑葚果酒釀造過程進行擬合。Logistic方程為：

(2)

將該方程左右兩邊同時積分得：

(3)

式中：

μm1——最大比生長速率，h-1；

xm——最大菌體數量，×108CFU/mL；

x0——初始菌體數，×108CFU/mL；

xt——發酵t時間后菌體數量，×108CFU/mL；

t——發酵時間，h。

1.3.2 產物生成模型 在桑葚果酒發酵初期，由于酵母細胞處于適應階段，乙醇生成量少，當菌體進入對數生長期后，伴隨著菌體大量繁殖，乙醇代謝逐漸旺盛，穩定期的酵母乙醇產量也高，當代謝進入后期，乙醇濃度增加，酵母細胞代謝受抑制，同時糖含量的減少，導致乙醇生成含量減少并趨于穩定，乙醇生成模型同樣為“S”曲線，綜合考慮，本試驗乙醇生成模型仍使用Logistic方程進行模擬預測。Logistic方程：

(4)

將該方程兩邊同時積分后：

(5)

式中：

μm2——最大乙醇生成速率，h-1；

pm——最大乙醇體積分數，%；

p0——初始乙醇體積分數，%；

pt——發酵t時間后乙醇體積分數，%；

t——發酵時間，h。

1.3.3 底物消耗模型 桑葚果酒釀造過程中，底物中糖主要作用包括：① 作為酵母生長所需碳源，作為結構物質用于合成酵母自身物質；② 被酵母氧化產生能量；③ 生成乙醇；④ 產生改善酒體口感風味物質成分[19]。因此，在菌體生長、產物生成兩個模型基礎上，結合發酵過程中碳平衡計算，可得糖的消耗公式：

(6)

兩邊積分后得：

(7)

式中：

s(0)——初始糖含量，g/L；

s(t)——發酵t時間后糖含量，g/L；

x(t)——測定時刻菌體數量，g/L；

x(0)——初始菌體數量，×108CFU/mL；

yx/s——菌體得率系數，×108CFU/g；

p(t)——測定時刻乙醇體積分數，%；

yp/s——產物得率系數，mL/g；

ms——細胞碳源維持系數，h-1；

μm1——菌體最大比生長速率，h-1；

xm——最大菌體數量，×108CFU/mL；

t——發酵時間，h。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

根據體積分數為0%，2%，4%，6%，8%，10%的標準溶液，以正丁醇作內標，以乙醇峰面積與正丁醇峰面積的比值為縱坐標、乙醇體積分數為橫坐標作圖，見圖1(a)，得出標準曲線：y=0.372 6x-0.000 8；根據表1操作，得出葡萄糖標準曲線見圖1(b)，回歸曲線為：y=0.552 7x-0.012 2。

2.2 桑葚酒發酵過程中細胞數量、基質及產物的變化

按照1.2.2所示的發酵條件對桑葚酒進行發酵，并對發酵過程中的酵母數量、還原糖及乙醇體積分數進行測定，結果見圖2。由圖2可知，在0～8 h，糖含量由200.00 g/L減少為196.70 g/L，乙醇體積分數增加至0.2%，由于初始糖含量濃度較高，對酵母具有抑制作用，同時酵母處于適應期，此時乙醇生成量、糖消耗量幾乎無變化；8～24 h為酵母對數生長期，酵母數量由0.45×108CFU/mL迅速增加至2.55×108CFU/mL，糖含量由196.70 g/L降解為134.64 g/L，乙醇體積分數由0.22%增加為3.07%，酵母利用碳源合成自身物質的同時，部分用于代謝生成乙醇，糖消耗急劇增加，乙醇的生成隨著酵母的生長而增加；酵母生長進入穩定期后，其數量保持在2.83×108CFU/mL左右，發酵至100 h時，糖含量降為3.86 g/L，酒精含量為9.01%，此時酵母生長與死亡保持動態平衡。整個發酵過程糖醇轉化率為46%，結合式(7)及其參數分析可知，理論上每1 L發酵液中108.41 g糖用于合成乙醇，23.92 g糖用于酵母生長，67.67 g糖用于產生能量和風味物質。

圖1 乙醇體積分數標準曲線和葡萄糖標準曲線

圖2 桑葚果酒發酵過程中主要指標變化

Figure 2 The metabolic curves of fermentation process of Mulberry wine

由圖3可知，酵母生長速率在16 h左右達到最大，乙醇生成速率在48 h左右達到最大，乙醇最大生成速率出現晚于酵母最大生長速率，表明乙醇生成與細胞生長是部分偶聯型；糖消耗速率出現兩個最高峰，分別是酵母生長率最大時和乙醇產率最大時，表明基質的消耗過程主要用于酵母生長繁殖和代謝生成乙醇；在75 h以后，殘糖含量降低至5.4 g/L，乙醇體積分數為8.5%，酵母細胞2.84×108CFU/mL，基質消耗速率趨于平穩但不為零，表明此時糖的消耗主要不是用于乙醇生成，結合實際分析，有可能為維持酵母細胞代謝和生成芳香類物質。

2.3 模型參數求解

2.3.1 菌體生長動力學模型求解 根據試驗數據，利用origin 9.0軟件對數據進行分析并擬合，其結果見圖4；參數預測結果為x(0)=0.030×108CFU/mL，xm=2.836×108CFU/mL，μm1=0.274h-1，由非線性回歸和方差分析可知，R2=0.974，說明該模型能較好地模擬并預測酵母菌體生長的動態變化過程，將擬合值代入式(3)得模型方程：

圖3 桑葚果酒發酵過程中物質變化速率

Figure3Changesintherateofalcoholproduction,cellgrowthandinitialsugarconsumption

圖4 菌體生長真實值與預測值模型擬合曲線

Figure4Fittingcurveofactualvaluesandpredictivevaluesforcellgrowth

(8)

由圖4可知，擬合曲線初期與真實值差距較大，在對數生長期具有較高的擬合度。在0～4 h，酵母處于適應期，同時由于底物濃度的抑制作用，生長緩慢；在8～24 h，酵母處于對數生長期，此時發酵過程主要以酵母生長為主，伴有少量乙醇生成；當酵母進入穩定期，發酵罐中活菌數量保持動態平衡，此時發酵罐內主要進行產物生成過程，此時酵母細胞的抑制以產物抑制為主。

2.3.2 產物生成動力學模型求解 根據測定樣品中乙醇與正丁醇的比值，得出不同發酵時間的發酵液中乙醇體積分數，并利用origin 9.0軟件對其進行非線性擬合，結果見圖5。擬合結果顯示，pm=8.941%，p0=0.329%，μm2=0.095h-1，方差分析R2=0.988，該方程能較好的擬合酵母乙醇生成曲線。將所求參數代入式(5)，得：

(9)

由圖5可知，在發酵中期和后期產物的真實值與預測值均有較好的擬合度，乙醇生成動力學模型能較好地反應發酵過程中乙醇的變化情況。

圖5 產物生成真實值與預測值模型擬合曲線

Figure 5 Fitting curve of actual values and predictive values for alcohol production

(10)

擬合曲線見圖6。由圖6可知，在12～64h時，糖含量真實值與預測值較吻合。在發酵前期和后期，真實值與預測值有一定偏差，可能是發酵前期測量誤差導致的糖含量略微偏高，后期由于底物含量呈降低趨勢但不明顯，故導致方程擬合時誤差較大，總體上該動力學模型能較好的反映桑葚酒發酵過程中基質消耗的過程。

圖6 底物消耗真實值與預測值模型擬合曲線

Figure6Fittingcurveofactualvaluesandpredictivevaluesforsubstrateconsumption

2.3.4 模型驗證 為驗證模型可靠性，取250mL桑葚汁調整初始含糖量為200g/L，接種5%活化酵母后28 ℃恒溫發酵100h，每隔4h取樣測定其糖含量、乙醇體積分數、細胞含量，將模型預測值與實際值作對比，結果見表2。由表2可知，酵母數量模型預測值與實測值相對偏差僅為5.90%，乙醇體積分數相對偏差為7.05%，殘糖含量相對偏差為3.38%，說明模型方程能較好地反應發酵過程中酵母數量、乙醇體積分數和殘糖含量的變化過程,該模型參數對指導桑葚果酒發酵具有實際意義。

表2 模型預測值與實際值數據對比

3 結論

桑葚果酒釀造試驗中，在初始糖含量為200g/L條件下，接種5%活化酵母置于28 ℃恒溫培養，發酵100h后乙醇含量為9.01%，殘糖含量3.86g/L，酵母數量2.83×108CFU/mL。發酵8h時酵母進入對數生長期，24h后進入穩定生長期，隨著酵母生長乙醇產生，發酵至72h后糖含量減少緩慢，乙醇體積分數保持穩定，主發酵基本結束。應用Logistic模型方程，建立桑葚果酒釀造過程中菌體生長、底物消耗、產物生成的動力學模型，通過origin9.0軟件對方程進行非線性回歸及方差分析，得出模型預測值與實際值數據擬合R2分別為0.974，0.988，0.991，具有較高的擬合度，表明試驗所求動力學能較好地反應桑葚果酒發酵過程中菌體數量、底物消耗、產物生成的動態變化過程。

發酵動力學對工業化生產控制提供依據，本試驗探究的是桑葚汁含量較少情況下果酒釀造過程，其溫度、溶氧等條件易于控制，當發酵進入工業化生產，由于發酵體積增大，機械攪拌、溫度控制、泡沫等條件的共同作用，對酵母生長和代謝具有極大影響，發酵動力學相關參數的確定會有所不同[18]，因此，要建立適合于工業化控制的發酵動力學過程，需在工業化生產過程中進行相關研究，建立特定發酵條件的發酵動力學模型。

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The batch fermentation kinetics of mulberry fruit wine

HU Yong-zheng LI Ming-yuan LI Mei DING Wen-wu KANG Ling WANG Chong CHEN Jian-hua LI Chun-mei

(SchoolofFoodandBioengineering,XiHuaUniversity,Chengdu,Sichuan610039,China)

The laws of cell growth, product formation and substrate consumption during mulberry wine fermentation were studied with mulberry juice. The kinetic models were established throughLogisticmodel equation to fit the curves of cell growth, product formation and substrate consumption. The results showed as follows: When the initial sugar concentration was 200 g/L, the inoculation of activated yeast was 5%, and the fermentation time lasted for 100 h at 28 ℃, the residual sugar concentration of fermentation broth decreased to 3.86 g/L, the number of yeast increased to 2.83×108CFU/mL and the ethanol concentration reached 9.01%. The models fitted well for cell growth, product formation and substrate consumption. TheR2of models was 0.974, 0.988 and 0.991 respectively. Meanwhile, the models could reflect and predict the fermentation process of mulberry wine well.

mulberry; fruit wine; fermentation; kinetics

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.002

四川省科技支撐項目(編號：2015NZ0007)

胡永正，男，西華大學在讀碩士研究生。

李明元(1965-)，男，西華大學教授，碩士。 E-mail: limingyuan519@qq.com

2016—10—12