超聲波處理對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化性的影響

張清安 史芳芳 王 襲 范學輝 周寶龍

(1. 陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119； 2. 陜西朱鸚黑米酒業有限公司，陜西 洋縣 723300)

超聲波處理對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化性的影響

張清安1史芳芳1王 襲1范學輝1周寶龍2

(1. 陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119； 2. 陜西朱鸚黑米酒業有限公司，陜西 洋縣 723300)

研究了超聲處理對黑米酒中酚類物質、顏色及羥基自由基清除能力的影響。結果顯示：超聲波處理后黑米酒中總酚含量、總黃酮含量、總花青素含量及清除自由基能力均有不同程度下降，而黑米酒亮度(L*)、紅色(a*)及黃色(b*)的顏色特性均有一定程度增加；不同超聲條件處理后，黑米酒中總花青素含量與其a*有明顯相關性，表明總花青素是黑米酒呈現紅色的主體物質；超聲處理后黑米酒清除羥自由基的能力與黃酮、花青素等的變化呈明顯相關性。上述部分指標的變化與自然熟化過程變化基本一致，表明超聲在一定程度上可以起到輔助黑米酒熟化的作用。

超聲波；黑米酒；總酚；總花青素；顏色；抗氧化性

1963年，超聲波技術已被應用于葡萄酒熟化的相關研究，但由于超聲處理后紅酒的理化指標變化較小且無規律，還出現焦糊味[1]，所以該技術當時并未受到很大關注。

近年來，超聲波技術在葡萄酒陳化中的運用已經被大量報道，并被認為是最具發展前景的催陳技術之一[2-4]。超聲波技術用于酒類老化中，原理在于加速酒中物質間的理化反應以達到自然陳釀酒的品質。該技術一旦被應用不僅可以縮短酒的老化時間[5]，節省橡木桶、酒窖和廠房的使用，節約資金，而且可以滿足人們對葡萄酒等日益增長的需求量，但由于種種原因該技術的研究及其工業化應用仍面臨一定問題[6]。目前，對于該領域的研究主要圍繞表觀描述紅酒中酚類、黃酮、pH等指標在超聲作用下的變化[5]。冷慧娟等[7]研究發現，超聲處理后葡萄酒中總酚含量變化不顯著。Zhang等[8]用EPR研究超聲誘導紅葡萄酒所產生的自由基，發現了羥基自由基和1-羥乙基自由基，為從內在機制方面闡述其變化提供了依據。申遠等[9]研究發現超聲處理可以顯著提高紅葡萄酒的抗氧化能力。舒杰等[10]對黃酒模擬體系進行了超聲處理，研究了其揮發性物質和有機酸在超聲作用下的變化，結果顯示超聲波處理加速了乳酸和乙醇的酯化反應；促進了異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯等揮發性物質的揮發，使其含量降低。

黑米酒，是一種以黑米為原料經發酵和陳化后的酒。黑米營養豐富并具有良好的保健功效[11]，以黑米制作的酒中氨基酸含量豐富、種類較多[12]，維生素的含量也較高，尤以VE顯著；抗氧化性強，能夠預防冠心病等多種疾病[13-14]；此外，酒中還含有豐富的礦物質[15]。多酚類物質是黑米酒的主要活性成分，目前已報道的有11種酚類物質[16]。與其它酒類一樣，新釀制得黑米酒也需經過一段時間的陳化，使酒在橡木桶微氧環境作用下發生一定的變化，從而使其口感、風味、色澤能達到最佳。因此，陳釀過程中酚類物質、酒體顏色、抗氧化活性等的變化尤其值得關注。傳統的陳釀方法是自然熟化，由于其存在耗時長、勞動強度大、投資大等弊端，所以近年來有關人工催熟技術的報道較受關注，如激光法催熟、紅外線法催熟、催化劑催熟等，而且效果也令人鼓舞[17]。而關于超聲處理對黑米酒的品質(如顏色、酚類物質等)的影響尚未見到有關報道。

本研究擬利用超聲波處理黑米酒，探究不同超聲參數(如超聲功率、頻率及時間)作用下黑米酒中主要活性物質——多酚類的變化，以及消費者較為關注的酒體顏色和抗氧化性等品質的變化，以期為將超聲早日應用于黑米酒的快速陳化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

黑米酒：添加了從黑米中提取的原花青素提取物，并預先在不銹鋼桶中貯藏兩年，陜西朱鹮黑米酒業有限公司；

沒食子酸：分析純，Alfa Aesar-A Johnson Matthey Company；

蘆丁：分析純，中國食品藥品檢定研究所；

Folin-Ciocalteu：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；

Na2CO3、Al(NO3)3、NaOH、KCl、CH3COONa、濃鹽酸：分析純，西安化學試劑廠。

1.1.2 儀器

數控超聲波清洗機：KQ-300VDE 型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：BS200S-WEI 型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：SG4050C 型，上海安亭科學儀器廠；

全自動臺式色差計：SC-80C 型，北京康光光學儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：TU-1810 型，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲處理過程 通過前期預試驗結果并結合儀器實際情況，對以下因素進行了單因素試驗設計，分析其對黑米酒品質相關指標的影響。

(1) 超聲功率：固定超聲頻率100 kHz，超聲時間20 min，超聲溫度23 ℃，研究超聲功率分別為120，180，240，300 W時對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化物質的影響。

(2) 超聲頻率：固定超聲功率300 W，超聲時間20 min，超聲溫度23 ℃，研究超聲頻率分別為45，80，100 kHz 時對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化物質的影響。

(3) 超聲時間：固定超聲功率300 W，超聲頻率100 kHz，超聲溫度23 ℃，研究超聲時間分別為20，40，60，80，100 min時對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化物質的影響。1.2.2 總酚含量測定 以沒食子酸為對照品，Folin-Ciocalteu法測定黑米酒中總酚含量[18]。以濃度C(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 總黃酮含量測定 以蘆丁為對照品，紫外法測定黑米酒中總黃酮含量[19]。以濃度C(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 總花青素含量測定 黑米酒中總花青素含量采用pH示差法測定[20]。取pH 1.0(KCl—HCl)緩沖液9 mL于10 mL比色管中，加入1 mL 黑米酒(待測樣品溶液)，混勻后放置110 min，分別于520 nm和700 nm下測其吸光度值。同樣的步驟，制備pH 4.5 的反應管，并于520 nm和700 nm下測其吸光度值。黑米酒中花青素含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷當量計，計算公式：

(1)

式中：

C——花青素含量(矢車菊素-3-葡萄糖苷當量)，mg/L；

A——在pH 1.0、4.5時吸光值差值的差，A= (A520 nm-A700 nm)pH 1.0- (A520 nm-A700 nm)pH 4.5；

MW——矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；

DF——稀釋倍數；

ε——摩爾吸光系數，26 900。

1.2.5 顏色測定 CIE Lab 值的測定采用SC-80C 型全自動臺式色差計直接進行測定。其中L*值表示明度，稱為明度指數，L*=100表示白色，L*=0表示黑色；a*、b*為色品指數，+a*代表紅色，-a*代表綠色，+b*代表黃色，-b*代表藍色。

1.2.6 羥自由基清除率測定 采用水楊酸法[21]。在25 mL比色管中依次加入9 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液2 mL，不同樣品液2 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O22 mL啟動反應，搖勻，蒸餾水定容，靜置30 min后于510 nm處測其吸光值A。計算公式：

(2)

式中：

P——?OH清除率，%；

A0——未加入酒樣時的吸光值；

A——加入酒樣時的吸光值；

A1——無顯色劑、加入酒樣時的吸光值。

1.2.7 數據處理 以上所有測定均重復進行3次，使用Microsoft Office Excel和DPS進行相關圖表的繪制和數據處理。

2 結果與分析

2.1 超聲功率對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化性的影響

2.1.1 酚類物質變化 由上述試驗方法可得測定黑米酒中多酚類物質的回歸方程為：y=0.009 7x+0.008 3，R2=0.999 6。在20～100 μg/mL濃度范圍內，標準品沒食子酸濃度C(x)與吸光度A(y)之間具有良好的線性關系。對于黃酮含量的測定可用方程y=0.001x+0.003 4進行計算，在蘆丁濃度為100～500 μg/mL范圍內，濃度C與吸光度A之間具有良好的線性關系，R2=0.999 3。

由圖1可知，與未處理黑米酒(原酒)比較，不同超聲功率處理后酒樣的總酚含量變化不明顯，但黃酮和花青色素含量變化明顯。超聲功率從120 W增加到300 W時，酒樣中總花青素和總黃酮含量均呈下降趨勢。針對酚類物質的變化其可能原因：① 與自然陳化過程相比，超聲輔助催陳幾乎沒有氧氣參與，但超聲空化會產生瞬時高溫、高壓等環境從而誘導自由基的產生，因此發生的理化變化遠比自然陳釀要復雜得多[22]；② 福林酚法在進行測定時并沒有選擇性，其原理僅是氧化還原反應。因此，雖然多酚類物質在超聲作用下有可能變化了，但福林酚法可能也把變化產物測定在內，所以導致用該法測定的總酚含量變化并不顯著[18, 23-24]。

2.1.2 顏色變化 由表1可知，超聲處理后黑米酒的L*、a*、b*值均有所增加，即黑米酒的亮度、紅色和黃色色澤都增加，說明超聲處理可改善黑米酒的部分顏色指標。隨著超聲功率的增加，酒樣的L*、a*、b*先增加后降低的趨勢；超聲功率為300 W時，酒樣的L*、a*、b*最小。

圖1 超聲功率對總酚、總黃酮、總花青素含量的影響

Figure 1 Effect of ultrasonic power on total phenolics, flavonoids and anthocyanins content

表1 超聲功率對黑米酒L*、a*、b*的影響?

Table 1 Effect of ultrasonic power onL*,a*,b*of black rice wine

超聲功率/WL*a*b*原酒17.94±0.41a41.13±0.20a6.54±0.39a12028.04±0.06b53.43±0.14b17.29±0.21bc18028.25±0.21b53.61±0.58b18.52±0.79b24028.55±0.39b54.63±0.65c19.62±0.61b30025.04±0.15c51.01±0.06d15.17±0.80c

? 同一行數據后不同字母表示在P<0.05 水平上存在顯著差異。

利用DPS統計軟件對不同超聲功率處理下酒樣中酚類物質及L*、a*、b*間的相關性進行分析，結果見表2。當相關系數臨界值a=0.05時，r=0.878 3，因此，超聲功率與總黃酮含量之間有明顯相關性，系數為-0.899 3；總花青素含量與酒樣紅色值a*也明顯相關(-0.882 8)。另外，L*與a*、b*，a*與b*之間也明顯相關，系數分別為0.994 9，0.992 3，0.994 7，說明酒樣亮度與紅色值和黃色值呈顯著相關性。2.1.3 自由基清除能力的變化 由圖2可知，超聲處理后大部分酒樣清除自由基的能力有所下降，但其與超聲功率的變化并不呈明顯相關性。其原因可能是超聲處理使酒中總黃酮、花青素等物質減少，從而使其抗氧化能力相對減弱。與原酒相比，超聲功率為240 W時，清除自由基能力有所增強，但與其他超聲功率相比并沒有顯著變化，其可能與黃酮、花青素等降解產物相關，其具體機理有待于進一步研究。

圖2 超聲功率對自由基清除率的影響

指標總酚含量總黃酮含量總花青素含量L*a*b*超聲功率-0.3379-0.8993*-0.84820.64640.71690.7069總酚含量0.06490.7489-0.7839-0.7671-0.7081總黃酮含量0.6640-0.2703-0.3652-0.3420總花青素含量-0.8390-0.8828*-0.8429L*0.9949*0.9923*a*0.9947*

? *表示在P≤ 0.05水平下存在顯著性差異。

2.2 超聲頻率對黑米酒中酚類物質、顏色及抗氧化性的影響

2.2.1 酚類物質變化 由圖3可知，不同超聲頻率作用下，黑米酒中總酚、總黃酮和花青素含量均有所變化；其中在80 kHz超聲處理下變化較為明顯，總酚含量降低2.14%，總黃酮、總花青素含量分別降低了1.76%和16.08%。一般來說，超聲空化導致氣泡破裂產生自由基，所用超聲頻率越高、周期越短，為空泡生長、爆炸崩潰等空化過程所提供的時間就越不足，空化效應被減弱，對物質的降解速率就減弱[25]。本試驗中80 kHz條件下所得數據與已有報道[26]變化一致，即存在一個最佳頻率點，在此頻率上空化強度可達到最大值(閾值)。此條件下，與原酒相比總酚、總黃酮、總花青色素都有所下降；但與45 kHz和100 kHz相比，80 kHz下降較小，說明80 kHz可能是這個最佳頻率點或者接近最佳頻率點，這與莫瑞深[27]對黃酒超聲陳化試驗結果基本一致。

2.2.2 顏色變化 由表3可知：與未經處理黑米酒相比，處理后L*、a*、b*值均顯著增加，但不同頻率處理酒樣間的差異不顯著。說明該處理對其亮度、紅色及黃色等色澤指標均有影響；但不同超聲頻率處理酒樣L*、a*、b*的變化并不顯著。

將不同超聲頻率處理酒樣中酚類物質及L*、a*、b*進行相關性分析，結果見表4。在相關系數臨界值a=0.05時，r=0.950 0，而總酚含量與b*之間r=-0.961 6，說明存在明顯相關性；總花青素含量與L*和a*的相關系數分別為-0.987 4和-0.984 5，說明總花青素含量與黑米酒的亮度和紅色值間有明顯相關性。此外，L*與a*也存在明顯相關性(r=0.999 8)，表明酒樣亮度與紅色色值也有明顯相關性。

圖3 超聲頻率對總酚、總黃酮、總花青素含量的影響

Figure 3 Effect of ultrasonic frequencies on total phenolics, flavonoids, and anthocyanins content

表3 超聲頻率對黑米酒L*、a*、b*的影響?

Table 3 Effect of ultrasonic frequencies onL*,a*,b*of black rice wine

超聲頻率/kHzL*a*b*原酒17.94±0.41a41.13±0.20a6.54±0.39a4524.44±0.37b50.23±0.64b13.56±2.06b8024.52±0.35b50.48±0.81b14.62±2.22b10025.04±0.15b51.01±0.06b15.17±0.80b

? 同一行數據后不同字母表示在P<0.05 水平上的顯著性差異。

2.2.3 自由基清除能力的變化 由圖4可知，與原酒比較，不同超聲頻率處理后黑米酒清除自由基能力均有不同程度下降；雖然對于45 kHz頻率處理后其下降并不顯著，可能是該頻率下的超聲空化效率較強，空化泡較多，導致其有略微上升，但用80 kHz和100 kHz處理后，酒樣清除能力分別為36.27%和36.41%，明顯低于原酒清除自由基能力。其原因可能與超聲處理后酒樣中黃酮、花青素類物質下降有關。

2.3 超聲時間對黑米酒中酚類物質、色差及抗氧化性的影響

2.3.1 酚類物質變化 由圖5可知，與原酒相比，不同超聲時間處理對黑米酒中總酚含量變化影響不顯著。對于總花青素而言，隨著超聲時間的延長，其含量整體呈下降趨勢，而且超聲20 min時下降最多。黃酮含量呈先降后升再降的變化趨勢，這與筆者[28]前期研究結果基本一致。

圖4 超聲頻率對自由基清除率的影響

指標總酚含量總黃酮含量總花青素含量L*a*b*超聲頻率-0.7628-0.7861-0.90020.88720.88650.8935總酚含量0.41260.8252-0.9038-0.9111-0.9616*總黃酮含量0.8528-0.7594-0.7483-0.5122總花青素含量-0.9874*-0.9845*-0.8521L*0.9998*0.9092a*0.9154

? *表示在P≤ 0.05水平下存在顯著性差異。

圖5 超聲時間對總酚、總黃酮、總花青素含量的影響

Figure 5 Effect of ultrasonic time on total phenolics, flavonoids and anthocyanins content

2.3.2 顏色變化 由表5可知，超聲處理可以使黑米酒的L*、a*和b*值發生顯著變化。對于酒樣L*而言，隨著超聲時間的延長其變化呈先增后基本穩定的趨勢，即超聲處理可以使酒樣亮度增加，但長時間超聲對酒樣的亮度影響不顯著。隨著超聲時間的延長，酒樣的a*和b*值也呈先增后減變化趨勢，這些變化與花青素等的變化有一定聯系。

表5 超聲時間對黑米酒L*、a*、b*的影響?

Table 5 Effect of ultrasonic time onL*,a*,b*of black rice wine

超聲時間/minL*a*b*原酒17.94±0.41a41.13±0.20a6.54±0.39a2025.04±0.15b51.01±0.06b15.17±0.80b4025.74±0.30b50.86±0.86bc13.87±2.27bc6024.58±0.25b49.97±0.47bc13.03±0.91bc8024.55±0.36b49.86±0.78c13.01±2.38bc10024.86±5.58b46.90±0.65d11.08±2.04d

? 同一行數據后不同字母表示在P<0.05 水平上存在顯著性差異。

由表6可知，在相關系數臨界值a=0.05時，r=0.811 4，總酚含量與L*有明顯相關性，系數為-0.837 6；總花青素含量與L*、a*和b*之間也明顯相關，系數分別為-0.941 1，-0.916 1，-0.917 4，說明總花青素等酚類物質與黑米酒顏色之間存在顯著相關性；花青素等酚類物質是構成黑米酒顏色的重要物質。

表6 酒樣酚類等物質與L*、a*、b*的相關性?

? *表示在P≤ 0.05水平下存在顯著性差異。

2.3.3 自由基清除能力的變化 由圖6可知，隨著超聲時間從20 min延長到100 min，酒樣清除自由基能力呈先增后減再增的變化。總體而言，其變化與黃酮類物質的變化存在一致性，說明超聲波可能是通過影響酒中黃酮類物質的含量進而影響其清除自由基的能力。

3 結論

通過研究發現，超聲波處理后黑米酒中總酚、總黃酮及總花青素含量均有所改變，酒的亮度、紅色及黃色等顏色特性值也均有所改變；而且超聲條件不同時，其變化也不盡一致。整體而言，超聲處理后酒樣的多酚、黃酮和花青素類物質變化均呈下降趨勢，只是程度不同而已，其主要原因在于超聲降解，尤其長時間處理將使降解更明顯、產物更復雜、變化也更無序。就顏色特性和清除自由基能力來說，其變化與酚類、黃酮和花青素之間存在高度相關性。尤其顏色及酚類物質等更接近自然老化過程酒類的變化。說明超聲處理可以在一定程度上起到加速黑米酒熟化的輔助作用。但超聲處理過程中各物質具體變化機理及參數控制和優化還需進一步研究。

圖6 超聲時間對自由基清除率的影響

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Effect of ultrasonic treatment on phenolic compounds, colour and antioxidant activity of black rice wine

ZHANG Qing-an1SHI Fang-fang1WANG Xi1FAN Xue-hui1ZHOU Bao-long2

(1.SchoolofFoodEngineeringandNutritionSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi'an,Shaanxi710119,China; 2.ShaanxiCrestedIbisricewineCo.,Ltd.,Yangxian,Shaanxi723300,China)

The effects of ultrasound irradiation were studied on the phenolic compounds, color and hydroxyl radical scavenging ability of black rice wine. The results showed that the total content of phenolic, flavonoids, anthocyanins and the scavenging capacity of hydroxyl radical for the black rice wine decreased after ultrasonic treatment, while the brightness (L*), redness (a*) and yellowness (b*) of wine color had some certain increasing. Furthermore, the total anthocyanins content highly correlated with the color ofa*in the black rice wine under the ultrasound irradiation, which suggests that the total anthocyanins may contribute to the redness of the black rice wine. In addition, the scavenging ability on hydroxyl radical was in accordance with the changes of flavonoids and anthocyanins for the black rice wine. Moreover, some of the parameters in the ultrasonically treated wine coincide with the changing trend of the wine aged by convention method, suggesting that ultrasound can accelerate the ageing of black rice wine in a certain extent.

ultrasound; black rice wine; total phenolics; anthocyanins; colour; antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.001

國家自然科學基金青年科學基金項目(編號：31101324)；陜西省自然科學基金項目(編號：2015JM3097)；西安市科技局技術轉移促進工程項目[編號：CXY1434(5)]；中央高校基本科研業務費專項(編號：GK201602005)

張清安(1976—)，男，陜西師范大學副教授，博士后。 E-mail：qinganzhang@snnu.edu.cn

2016—10—09