人腦膠質瘤干細胞增殖中NOTCH信號的調控作用*

徐菲陳東胡繼良

人腦膠質瘤干細胞增殖中NOTCH信號的調控作用*

徐菲①陳東①胡繼良①

目的：探討人腦膠質瘤干細胞增殖中NOTCH信號的調控作用。方法：采用免疫磁珠法從人腦膠質瘤組織及膠質瘤細胞株中提取、分離人腦膠質瘤干細胞，對細胞進行體外培養，采用熒光定量PCR、免疫組化等方法檢測相關指標，觀察人腦膠質瘤干細胞增殖中NOTCH信號通路的調控作用。結果：正常腦組織的NOTCH-1蛋白累積光密度值為（294.9±29.5），低度及高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度值分別為（5046.0±120.9）和（11 026.2±169.1）。低度及高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白表達水平較正常腦組織患者明顯提高，且高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白表達水平較低度惡性膠質瘤患者明顯提高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。在CD133+膠質瘤細胞中，NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表達水平較CD133-膠質瘤細胞明顯提高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：NOTCH-1基因在人腦膠質瘤中呈高水平表達；在人膠質瘤干細胞增殖過程中，NOTCH-1、CBF-1和HES-1等關鍵基因呈高表達，NOTCH信號通路在人腦膠質瘤干細胞增殖過程中起著重要調控作用，值得深入研究。

人腦膠質瘤干細胞； 增殖； NOTCH信號； 調控作用

First-author’s address：The People’s Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518020，China

NOTCH基因從無脊椎動物到脊椎動物，在多個物種中均有表達，其家族成員的結構具有高度保守性，在細胞增殖分化及發育過程中起著關鍵調節作用［1-2］。目前研究表明，NOTCH-1信號通路在神經前體細胞及神經干細胞的增殖分化中具有重要作用［3-4］。目前對于NOTCH信號對人腦膠質瘤干細胞增殖的調控研究較少，所以進行該研究具有重要價值［5］。本研究采用免疫磁珠法從人腦膠質瘤組織及膠質瘤細胞株中提取、分離人腦膠質瘤干細胞，對細胞進行體外培養，采用熒光定量PCR、免疫組化等方法檢測相關指標，觀察人腦膠質瘤干細胞增殖中NOTCH信號通路的調控作用，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 此次研究所采用的人腦膠質瘤新鮮標本取自2011年4月-2014年4月于本院進行人腦膠質瘤手術的30例患者，其中14例為低度惡性膠質瘤，16例為高度惡性膠質瘤。另擇同期進行顱內減壓術20例患者的正常新鮮腦組織作為對照組。本研究采用的U251惡性膠質瘤細胞株和CHG-5膠質瘤細胞株由本院細胞實驗室提供。

1.2方法 （1）細胞培養：膠質瘤新鮮標本及U251、CHG-5細胞株的分選采用免疫磁珠法。將分離出的腦膠質瘤干細胞進行培養，控制每瓶細胞數約為1×105個，向細胞培養瓶內分別加入含血清培養基及無血清培養基，培養溫度為37 ℃、二氧化碳濃度為5%，濕度為95%。每隔2天對細胞進行換液處理，培養約5 d左右進行傳代。待細胞生長狀態良好時進行實驗［6-8］。（2）NOTCH-1信號通路相關基因的表達檢測：采用Trizol法提取膠質瘤干細胞的總RNA，采用熒光定量PCR法對NOTCH-1信號通路相關基因的表達進行檢測，檢測的基因包括NOTCH-1、CBF-1、HES-1，內參基因選擇GAPDH，實驗所采用的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，SYBR green由北京康為世紀生物科技有限公司提供。實驗結果由熒光定量PCR儀自帶軟件進行處理分析［9］。（3）NOTCH-1蛋白的表達檢測：將人腦膠質瘤組織和正常人腦組織標本送病理科做冰凍切片，然后對NOTCH-1蛋白進行免疫組化染色。免疫組化染色采用SABC法，免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。染色完成后對切片進行顯微鏡鏡檢，棕黃色為陽性區域。采用Image Pro Plus 6.0軟件測定各切片陽性區域的累積光密度值（IOD）。

1.3觀察指標 觀察人腦膠質瘤組織和正常人腦組織中的NOTCH-1蛋白表達情況和人腦膠質瘤干細胞增殖過程中NOTCH-1信號通路的相關基因表達情況。

1.4統計學處理 使用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1三組腦組織切片蛋白表達情況比較 在對三組腦組織切片的NOTCH-1蛋白陽性區域分析后得出：正常腦組織的NOTCH-1蛋白累積光密度值為（294.9±29.5），低度及高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度值分別為（5046.0±120.9）和（11 026.2±169.1）。低度及高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白表達水平較正常腦組織患者明顯提高，且高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白表達水平較低度惡性膠質瘤患者明顯提高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2人腦膠質瘤干細胞增殖過程中NOTCH-1信號通路的相關基因表達情況分析 收集2株膠質瘤細胞，將從同株膠質瘤中分離得到的CD133-膠質瘤細胞作為參考對照，其中1株來源于病理分型為星型細胞瘤Ⅱ級的患者，另1株來源于病理分型為多形性膠質母細胞瘤Ⅳ級的患者，另外加上U251細胞株和CHG-5細胞株，對4株細胞進行熒光定量PCR檢測，結果發現：在CD133+膠質瘤細胞中，NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表達水平較CD133-膠質瘤細胞明顯（P＜0.05），見表1。

表1　人腦膠質瘤干細胞增殖過程中NOTCH-1通路的相關基因表達情況（±s）

*與CD133-比較，P＜0.05

HES- 1類別　NOTCH- 1 CBF-1 CD133-　CD133+　CD133-　CD133+　CD133-　CD133+星型細胞瘤Ⅱ級　1.0　5.6±1.2*　1.0　6.1±0.9*　1.0　7.3±1.6*多形性膠質母細胞瘤Ⅳ級　1.0　5.9±1.3*　1.0　4.9±1.1*　1.0　4.6±0.8*U251細胞株　1.0　7.6±1.5*　1.0　3.9±0.6*　1.0　4.2±0.9*CHG-5細胞株　1.0　10.5±1.9*　1.0　4.6±1.0*　1.0　5.0±1.1*

3　討論

在臨床上，膠質瘤是一種常見的中樞神經系統惡性腫瘤［10］。近年來，膠質瘤患者的發病人數不斷增加，且發病率呈不斷上升趨勢。人腦膠質瘤對于患者而言具有巨大危害，不僅給患者帶來了巨大痛苦，對患者的生活質量造成了嚴重影響，而且該病的治療效果較差，患者的生存期限較短，僅僅有不到5%的腦膠質瘤患者的生存期可達5年［11-12］。由此可見看出，人腦膠質瘤對患者的生命健康構成了嚴重威脅［13］。目前，臨床上對于膠質瘤患者常采用放療、化療、外科手術治療及免疫抑制治療等，然而治療效果常不理想。所以，探討人腦膠質瘤增殖的信號通路研究可進一步弄清該病的發病機制，可為人腦膠質瘤臨床治療新靶點的選取提供有力參考，對提高該病的治療水平具有重要意義。

NOTCH基因首次發現于1919年，該基因若發生突變可導致果蠅出現殘翅。隨著醫學研究的不斷深入，NOTCH基因被發現存在于無脊椎動物到脊椎動物的多個物種中，并且NOTCH基因家族的成員具有高度保守性。Artavanis-tsakonas等［7］研究表明，NOTCH-1基因不僅在正常細胞的增殖發育過程中起著重要作用，而且與一些腦部腫瘤的發生與發展有著密切聯系。除此以外，FAN等［8］研究發現HES-1為NOTCH信號通路的重要基因之一，且該基因在髄母細胞瘤患者中的表達水平與患者的治療及預后密切相關［14］。目前，NOTCH信號通路與膠質瘤發病的研究是一個醫學研究熱點，探討NOTCH信號通路對膠質瘤細胞增殖的調控作用，可進一步明確調控機制，可為靶向治療和基因治療等新型治療手段提供理論依據［15-16］。本研究選取了低度、高度惡性膠質瘤患者及正常人腦組織作為標本，進行NOTCH-1蛋白免疫組化分析，結果顯示：低度及高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白表達水平較正常腦組織患者明顯提高，且高度惡性膠質瘤患者的NOTCH-1蛋白表達水平較低度惡性膠質瘤患者明顯提高，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。另外，本研究收集了2株膠質瘤細胞及U251細胞株及CHG-5細胞株作為實驗細胞株，對NOTCH-1信號通路的關鍵基因的表達進行分析，結果顯示：在CD133+膠質瘤細胞中，NOTCH-1、HES-1及CBF-1基因的表達水平較CD133-膠質瘤細胞明顯提高（P＜0.05）。從膠質瘤細胞株中分離出來的CD133+膠質瘤細胞僅僅占很小一部分，這一小部分CD133+膠質瘤細胞具有分化及連續傳代功能，為膠質瘤干細胞。上述研究結果表明，NOTCH信號通路中的關鍵性蛋白NOTCH-1在正常腦組織切片及CD133-細胞株中僅有少量表達，而在膠質瘤切片及CD133+細胞株中表達顯著上調，并且高度惡性膠質瘤的表達水平高于低度膠質瘤［17］。HES-1和CBF-1基因與NOTCH-1信號通路密切相關，在CD133+細胞株中，HES-1和CBF-1基因的表達水平較CD133-細胞株的表達明細升高，這提示NOTCH-1信號通路參與了腦膠質瘤干細胞的增殖，對其增殖起著重要的調控作用［18-20］。

綜上所述，本研究探討了人腦膠質瘤干細胞增殖中NOTCH信號的調控作用，為人腦膠質瘤的治療提供了一定參考。

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NOTCH Signal Regulating Role in Human Brain Glioma Stem Cells Proliferation

XU Fei，CHEN Dong，HU J i-liang.//Medical Innovation of China，2016，13（21）：018-021

Objective：To study the NOTCH signal regulating role in human b rain glioma stem cell proliferation.Method：Using magnetic beads immune method extracted from the organization for human brain glioma and glioma cell line，separated the brain glioma stem cells，cells for in vitro culture，used the fluorescent quantitative PCR and immunohistochemical method to detect the related indicators，observed the NOTCH signal pathway in the brain glioma stem cells proliferation regulation function.Result：Patients with normal brain tissue protein accumulation NOTCH-1 optical density value was（294.9±29.5），low and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein accumulation optical density value was respectively（5046.0±120.9） and（11 026.2±169.1）. Low and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein expression levels significantly higher than patients with normal brain tissue，and highly malignant gliomas NOTCH-1 protein expression levels was significantly increased than low grade gliomas（P＜0.05）.In CD133+glioma cells，NOTCH-1，CBF-1 and HES-1 gene expression level of CD133 glioma cells increased significantly（P＜0.05）.Conclusion：The NOTCH-1 gene is the high level expression in human brain gliomas.In the process of human glioma stem cells proliferation，NOTCH，CBF-1 and HES-1 key genes has high expression，such as NOTCH signaling pathways in the brain glioma stem cells proliferation plays an important regulatory role in the process，it is worth of further study.

Human brain glioma stem cells； Proliferation； NOTCH signal； Regulation effect

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.005

深圳市知識創新計劃-基礎研究項目（20140318221052）
①廣東省深圳市人民醫院 廣東 深圳 518020

胡繼良

2016-05-04） （本文編輯：李穎）