大孔樹脂富集酸棗仁總黃酮工藝及其體外抗氧化性研究

趙 旭,張斯桐,劉春梅,顏廷旭,肖 鋒,賈 英,*

(1.沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院,遼寧沈陽 110016;2.沈陽藥科大學中藥學院,遼寧沈陽 110016)

大孔樹脂富集酸棗仁總黃酮工藝及其體外抗氧化性研究

趙 旭1,張斯桐1,劉春梅2,顏廷旭2,肖 鋒1,賈 英1,*

(1.沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院,遼寧沈陽 110016;2.沈陽藥科大學中藥學院,遼寧沈陽 110016)

研究大孔吸附樹脂富集純化酸棗仁總黃酮的最佳條件,并進行了總黃酮體外抗氧化能力的測定。利用靜態吸附和動態吸附實驗對5種不同極性的大孔吸附樹脂進行篩選,并對上樣液質量濃度、上樣量、洗脫劑體積分數、洗脫劑體積以及洗脫劑流速等條件分別進行考察。采用DPPH自由基和ABTS自由基的清除率以及鐵氰化鉀的還原能力作為指標考察純化后總黃酮的體外抗氧化能力。結果表明AB-8大孔吸附樹脂為純化酸棗仁總黃酮的最佳樹脂,純化工藝為上樣液質量濃度1.99 mg/mL,上樣量50 mL,洗脫劑體積分數50%乙醇,洗脫劑體積50 mL,洗脫劑流速1 mL/min,純化后總黃酮的回收率為77.0%,純度為51.4%。抗氧化結果顯示總黃酮對DPPH和ABTS自由基具有明顯的清除能力(IC50值為0.70 mg/mL和0.15 mg/mL),并對鐵氰化鉀表現出了較強的還原能力。

酸棗仁,總黃酮,大孔吸附樹脂,體外抗氧化能力

酸棗仁為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.var. spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou]的干燥成熟種子,味甘、酸,性平,歸肝、膽、心經。具有養心補肝、寧心安神、斂汗、生津之功效,用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗和津傷口渴等癥狀[1]。現代藥理學發現,酸棗仁在鎮靜催眠、改善學習記憶、抗抑郁、抗焦慮以及抗炎等方面都有較多的應用[2]。酸棗仁富含脂肪油,其他成分有酸棗仁皂苷、黃酮、維生素C、氨基酸和微量元素,其中藥用的物質基礎研究較廣的是皂苷類和黃酮類成分[3]。

黃酮類化合物分布廣泛,具有多種生物活性:如心血管系統活性、抗氧化自由基、抗衰老、提高機體免疫力等。黃酮類物質的純化主要有大孔樹脂[4-5]、聚酰胺柱色譜法[6]、超聲輔助[7]以及高效液相色譜法。其中大孔吸附樹脂因其選擇性好、吸附速度快、吸附量大、機械強度高、穩定性強、再生處理簡便等特點,在天然產物活性成分的分離純化中應用較多[8-9],適合于中藥材中總黃酮的富集。關于酸棗仁中總黃酮的純化方法,王勇[10]等報道了采用6種大孔樹脂進行富集的工藝,然而,有關酸棗仁高純度總黃酮的抗氧化活性鮮有報道。本研究擬采用與先前報道不同的5種大孔吸附樹脂對酸棗仁總黃酮進行富集純化,利用靜態吸附和動態吸附相結合的方法[11],篩選最佳大孔吸附樹脂,優化純化條件并進行驗證,得到的高純度總黃酮采用·DPPH、ABTS+·和Fe3+三種模型對其進行體外抗氧化評價,為酸棗仁體內外活性的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁藥材 沈陽市同仁堂藥房,批號:1401001,經沈陽藥科大學賈英教授鑒定,均為正品,密封存放于陰涼干燥處;DPPH、ABTS、蘆丁對照品 大連美侖科技有限公司,純度98%;5種大孔吸附樹脂(HPD100、NKA、DM130、AB-8、HP20) 河北省滄州寶恩吸附材料科技有限公司;亞硝酸鈉(NaNO2)、氫氧化鈉(NaOH)、硝酸鋁[Al(NO3)3]、抗壞血酸(VC)、硫酸亞鐵(FeSO4)、過硫酸鉀(K2S2O8)、鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]山東禹王化學試劑有限公司。

HH-4型數顯電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;SHA-CA型水浴恒溫振蕩器 金壇市宏華儀器廠;Varioskan Flash酶標儀 賽默飛世爾科技公司;UV-1700紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮含量測定 取經120 ℃恒溫干燥至恒重的蘆丁對照品約10.0 mg,精密稱定,置于50 mL量瓶中,加入適量的無水乙醇,超聲至溶解后放冷,以無水乙醇稀釋定容,搖勻,即得0.200 mg/mL蘆丁對照品溶液。精密量取對照品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL量瓶中,不足6 mL的加蒸餾水補足,加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻,放置6 min,加氫氧化鈉試液10 mL,加水至刻度,搖勻,放置15 min。以空白試劑作為參比試液,在510 nm波長處測定吸光度A,以蘆丁濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。其線性回歸方程為A=7.860C+0.014(r=0.9994)。

1.2.2 供試品的制備 酸棗仁干燥果實1.6 kg,粉碎,60%乙醇作為提取溶劑,液料比為10∶1,加熱回流提取3次,每次2 h,合并濾液并減壓濃縮,得酸棗仁總提物浸膏共330.2 g。稱取浸膏225 g用3000 mL蒸餾水溶解,5000 r/min離心,取上清得供試品溶液。量取定量供試品溶液于25 mL量瓶中,按照1.2.1方法處理樣品并在510 nm波長處測定吸光度,由線性回歸方程求得供試品中總黃酮濃度。

1.2.3 大孔吸附樹脂的篩選

1.2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理 稱取適量吸附樹脂HPD100、NKA、DM130、AB-8、HP20,用95%乙醇浸泡24 h,充分溶脹后,用95%乙醇淋洗至洗出液加適量蒸餾水無白色渾濁為止,用大量蒸餾水淋洗至無醇味,用濾紙吸去樹脂表面水分,備用。

1.2.3.2 靜態吸附實驗 分別取預處理過的5種吸附樹脂各2 g于100 mL具塞錐形瓶中,分別加入供試品溶液50 mL,密封后置于恒速振蕩器振蕩吸附24 h。取吸附后的上清液,測其吸光度并根據線性回歸方程計算總黃酮濃度,并按式(1)計算5種吸附樹脂的靜態吸附率。將吸附后的樹脂用濾紙吸干表面殘留液,置于100 mL具塞錐形瓶中,各加入50%乙醇30 mL,密封后置于恒速振蕩器振蕩6 h,取解吸后上清液,測其吸光度并計算總黃酮濃度,并按式(2)計算5種吸附樹脂的靜態解吸率。最后按式(3)計算總黃酮的回收率。

吸附率(%)=(吸附前總黃酮質量濃度-吸附后總黃酮質量濃度)/吸附前總黃酮質量濃度×100

式(1)

解吸率(%)=解吸附后總黃酮質量濃度/(吸附前總黃酮質量濃度-吸附后總黃酮質量濃度)×100

式(2)

富集總黃酮回收率(%)=吸附率×解吸率×100

式(3)

1.2.3.3 動態吸附實驗 分別取預處理過的5種吸附樹脂各5 g,濕法裝柱,量取供試品溶液50 mL于柱頂加入,以1 mL/min的加入流速進行動態吸附,預吸附50 min,過柱液重吸附1次后加到柱里放置過夜后,加5 BV蒸餾水以2 BV/h的流速進行洗脫,與過柱液混合定容,作為吸附后溶液。用50 mL 50%乙醇以2 BV/h的流速洗并定容,測定吸光度并計算黃酮含量,同時按式(1)～式(3)計算5種吸附樹脂的吸附率及解吸率。

1.2.4 黃酮純化工藝的優選

1.2.4.1 上樣液質量濃度的考察 稱取預處理的AB-8大孔吸附樹脂5份,每份5 g,濕法裝柱。將總黃酮濃度為0.249、0.498、0.995、1.99、2.388 mg/mL的上樣液各50 mL于柱頂加入,以1 mg/mL的加入流速通過柱體,充分飽和后測定過柱液中總黃酮含量并計算該大孔吸附樹脂的吸附率。

1.2.4.2 上樣量的考察 稱取預處理的AB-8大孔吸附樹脂5 g,濕法裝柱。量取100 mL總黃酮濃度為1.99 mg/mL的供試品溶液,以1 mg/mL的加入流速進行動態吸附,收集流出液,每5 mL收集一份,共收集20份,標號1～20,測定20份流出液的總黃酮含量。

1.2.4.3 洗脫劑體積分數的考察 稱取預處理的AB-8大孔吸附樹脂4份,每份5 g,濕法裝柱。分別量取50 mL總黃酮濃度為1.99 mg/mL的供試品溶液進行動態吸附,吸附完全后,用適量蒸餾水沖洗,再分別用30%、50%、70%、95%的乙醇洗脫,收集各洗脫液至50 mL,測定總黃酮含量。

1.2.4.4 洗脫劑用量的考察 稱取預處理的AB-8大孔吸附樹脂5 g,濕法裝柱。量取50 mL總黃酮濃度為1.99 mg/mL的供試品溶液進行動態吸附,吸附完全后,用適量蒸餾水沖洗,用100 mL 50%乙醇以1 mL/min的流速進行洗脫,每7 mL(1 BV)洗脫液收集一份,共10份,標號1～10,測定10份洗脫液的總黃酮含量。

1.2.4.5 洗脫流速的考察 稱取預處理的AB-8大孔吸附樹脂4份,每份5 g,濕法裝柱。量取50 mL總黃酮濃度為1.99 mg/mL的供試品溶液進行動態吸附,吸附完全后,用適量蒸餾水沖洗,用50 mL 50%乙醇分別以0.5、1、2、4 mL/min的流速進行洗脫,測定洗脫液總黃酮的含量。

1.2.4.6 驗證實驗 稱取預處理的AB-8大孔吸附樹脂3份,每份5 g,濕法裝柱。量取50 mL總黃酮濃度為1.99 mg/mL的供試品溶液進行動態吸附,吸附完全后,用適量蒸餾水沖洗,按照上述優選條件進行洗脫,收集洗脫液,蒸干后測定浸膏質量,計算總黃酮回收率及純度。

1.2.5 酸棗仁總黃酮體外抗氧化活性考察

1.2.5.1 供試品溶液和對照品溶液的制備 將大孔吸附樹脂所得的酸棗仁總黃酮樣品無水乙醇溶解后配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、2.5 mg/mL的系列濃度溶液,作為供試品溶液。以VC為陽性對照,以相同的方法配制成0.05～2.5 mg/mL的系列濃度溶液,作為對照品溶液,4 ℃儲存備用。

1.2.5.2 清除DPPH自由基能力 取DPPH約8.0 mg,精密稱定,無水乙醇溶解后于100 mL量瓶中定容,得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液。向2.5 mL DPPH溶液中加入0.4 mL供試品溶液,搖勻于室溫下放置30 min,于酶標儀中測定其在517 nm下吸光值Ai;以0.4 mL無水乙醇代替供試品溶液測得空白吸光度A0;以2.5 mL無水乙醇代替DPPH溶液測得樣品本底吸光度Aj;每個濃度做3個平行樣品,取其平均值,以VC做陽性對照,按式(4)計算供試品溶液對DPPH的抑制率清除率,并計算出IC50值[12]。

自由基抑制率SA(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式(4)

1.2.5.3 清除ABTS自由基能力 ABTS與過硫酸鉀反應生成穩定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·,在734 nm處具有最大吸收峰。精密移取7 mmol/L的ABTS水溶液10 mL和2.45 mmol/L的過硫酸鉀10 mL,混合,在室溫、避光的條件下靜置過夜(12～16 h),形成ABTS自由基儲備液,測定前用95%乙醇稀釋,使吸光度在0.70±0.02內。反應體系中加入0.1 mL的樣品溶液和5 mL ABTS溶液,充分混合后室溫放置6 min,在734 nm下測其吸光度Ai;以0.1 mL無水乙醇代替樣品溶液測得空白吸光度A0;以5 mL無水乙醇代替ABTS溶液測得樣品本底吸光度Aj;每個濃度做3個平行樣品,取其平均值,以VC做陽性對照,按式(4)計算樣品對ABTS自由基的抑制率,并計算出IC50值[13]。

1.2.5.4 鐵氰化鉀還原能力 反應體系中依次加入1.0 mL不同濃度的樣品溶液,1.0 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6)和1.0 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液,在45℃下水浴反應20 min后迅速冷卻,然后加入1.0 mL 10%的CCl3COOH溶液。取上述反應液2 mL,加入2 mL蒸餾水和0.1%的FeCl3溶液0.5 mL,搖勻,10 min后在695 nm下測定其吸光值,以VC做陽性對照,每個濃度做3個平行樣品,取其平均值[14]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 靜態吸附實驗

5種大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的靜態吸附和解吸能力有所不同,這與大孔樹脂的極性、平均孔徑和比表面積有關。結果見表1,其中弱極性的AB-8型樹脂對總黃酮的吸附率與解吸率都更具優勢,說明酸棗仁總黃酮極性較小。進一步將通過動態吸附實驗進行驗證并確定最佳大孔樹脂進行酸棗仁總黃酮的富集。

表1 大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的靜態吸附與解吸附性能

2.2 動態吸附實驗

結果如表2所示,AB-8大孔樹脂在動態吸附實驗中吸附率與解吸率均更優。綜合靜態和動態吸附實驗結果,確定AB-8作為酸棗仁總黃酮的最佳吸附樹脂。

表2 大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的動態吸附與解吸附性能

2.3 黃酮純化工藝的優選

2.3.1 上樣液質量濃度的考察 結果如圖1所示,上樣液質量濃度在0.249～1.99 mg/mL時,吸附率迅速增加,質量濃度在1.99 mg/mL時吸附率達最大值,并隨著濃度的進一步增加而略有降低。考慮到上樣質量濃度過高時,容易發生絮凝和沉淀,堵塞樹脂柱。故確定1.99 mg/mL為該樹脂的最佳上樣質量濃度。

圖1 上樣液濃度的考察Fig.1 Study on the sample concentration

2.3.2 上樣量的考察 結果如圖2所示,當收集到第10份流出液時,流出液中總黃酮開始出現大量的泄漏,由此可以看出,當上樣量為50 mL時,樹脂吸附達到飽和。

圖2 泄漏曲線Fig.2 Leak curve

2.3.3 洗脫劑體積分數的考察 總黃酮洗脫率分別為49.65%、70.57%、71.36%、73.28%,表明當乙醇體積分數為90%時,洗脫效果最好,但與用50%和70%的乙醇洗脫,解吸率相差不大,且乙醇體積分數高易揮發,從經濟、節約成本方面考慮,采用50%乙醇洗脫。

2.3.4 洗脫劑用量的考察 結果如圖3所示,在洗脫劑體積為7個保留體積時,總黃酮基本洗脫完全,因此,選擇50 mL作為洗脫劑體積。

圖3 洗脫劑用量的考察Fig.3 Study on the volume of eluant

2.3.5 洗脫流速的考察 隨著洗脫流速的增加,總黃酮洗脫率分別為75.27%、74.66%、69.27%、68.29%。由此可以看出,洗脫流速越大,洗脫率越低,但是流速為1 mL/min和0.5 mL/min相差甚少,而且0.5 mL/min的流速耗時太長,因此選擇1 mL/min作為洗脫流速。

2.3.6 驗證實驗 經純化后總黃酮回收率為76.37%±0.79%,純度為51.40%±0.86%,純度較純化前(3.814%)提高了10倍以上,表明經AB-8型大孔樹脂處理后,總黃酮純度大大提高,且該工藝具有良好的重復性。

2.4 酸棗仁總黃酮體外抗氧化活性研究

2.4.1 清除DPPH自由基能力 DPPH自由基有單電子,在517 nm處有一強吸收,當有自由基清除劑存在時,由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失,從而可用吸光度進行快速的定量分析。結果如圖4所示,酸棗仁總黃酮濃度在0.05～2.5 mg/mL范圍內DPPH自由基抑制率隨著濃度的升高而升高,在2 mg/mL時達到91.3%,接近VC水平。酸棗仁總黃酮的IC50值為0.70 mg/mL。

圖4 DPPH自由基清除率測定Fig.4 Determination of DPPH radical scavenging capacity

2.4.2 清除ABTS自由基能力 ABTS在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS自由基,抗氧化劑存在時自由基的產生會被抑制,在734 nm處測定吸光度可計算供試品的抗氧化能力。結果如圖5所示,酸棗仁總黃酮濃度在0.05～2.5 mg/mL范圍內ABTS自由基抑制率隨著濃度的升高而升高,在0.5 mg/mL時達到91.3%,接近VC水平。酸棗仁總黃酮的IC50值為0.15 mg/mL。

圖5 ABTS自由基清除率測定Fig.5 Determination of ABTS radical scavenging capacity

2.4.3 鐵氰化鉀還原能力 良好的抗氧化劑通常還原能力較好,因此通過測定還原能力可間接的評價抗氧化劑的抗氧化活性,還原Fe3+是應用較廣泛的評價方法。結果如圖6所示,酸棗仁總黃酮濃度在0.05～2.5 mg/mL范圍內鐵氰化鉀還原能力隨著濃度的升高而升高,在2 mg/mL時吸光度達到3.60,接近VC水平。

圖6 鐵氰化鉀還原能力測定Fig.6 Determination of Fe3+ reduction capacity

3 結論

本研究選取5種不同極性的大孔吸附樹脂對酸棗仁總黃酮進行富集純化。靜態吸附和動態吸附實驗結果顯示,弱極性的AB-8型號大孔吸附樹脂富集回收率分別為77.94%和60.58%,效果顯著。進而對純化工藝中五個條件進行單因素考察,確定總黃酮濃度1.99 mg·mL-1、上樣量50 mL、洗脫劑體積分數50%、洗脫劑用量50 mL和洗脫流速1 mL/min為最佳條件,最終通過驗證實驗,表明該純化工藝富集效率較高,重現性良好。通過測定DPPH、ABTS自由基清除力以及鐵氰化鉀還原能力三種經典的體外抗氧化評價實驗,發現酸棗仁總黃酮對DPPH和ABTS自由基具有明顯的清除能力(IC50值為0.70 mg/mL和0.15 mg/mL),并對鐵氰化鉀表現出了較強的還原能力。酸棗仁總黃酮在濃度分別為2、0.5、2 mg/mL時達到與VC相近的抗氧化能力,說明其體外抗氧化能力較強。

近幾年隨著研究的不斷深入,植物性抗氧化活性成分在食品、化妝品和藥品等領域的開發與應用日益增多。酸棗仁作為傳統中藥材,在安神、鎮靜催眠等方面具有良好的治療效果。隨著藥材中抗氧化成分的不斷研究與開發,酸棗仁作為一種功能性藥食同源品種,在治療失眠、抑郁癥等神經退行性疾病方面將具有更廣闊的應用前景。

[1]中國藥典2015版第一部[S]. 2015:366.

[2]王茜,張艷強,楊艷婷,等. 酸棗仁的化學成分及應用研究進展[J]. 黑龍江醫學,2015(2):259-261.

[3]陳雯,黃世敬. 酸棗仁化學成分及藥理作用研究進展[J].時珍國醫國藥,2011,22(7):1726-1728.

[4]陳況況,章宏慧,劉東紅,等. 大孔吸附樹脂純化水芹總黃酮的研究[J]. 食品工業科技,2013,34(20):246-250.

[5]張華潭,鄭文麗,魏艷婷,等. 大孔樹脂純化黃蜀葵花總黃酮的工藝優選[J]. 中國實驗方劑學雜志,2015,21(1):28-31.

[6]司建志,王碩,周小雷,等. 聚酰胺純化八角殘渣黃酮的工藝研究[J]. 食品工業科技,2015,36(8):245-249.

[7]易陽,艾有偉,王宏勛. 蓮藕總黃酮的超聲波提取工藝優化[J]. 食品工業科技,2014,35(13):207-212.

[8]智秀娟,馬挺軍,丁軻,等. 大孔吸附樹脂分離純化苦蕎總皂苷的研究[J]. 食品工業科技, 2015,36(12):226-230.

[9]劉安軍,劉慧慧,郭丹霄,等. 大孔吸附樹脂分離純化枸杞葉總黃酮的研究[J]. 現代食品科技,2012,28(3):292-296.

[10]王勇,李洪福,魏娜,等. 大孔樹脂分離純化酸棗仁總黃酮的工藝優選[J]. 中國實驗方劑學雜志,2013,19(23):4-6.

[11]吳博,劉春梅,劉冰,等. 益智總黃酮大孔樹脂純化工藝研究[J]. 中草藥,2015,46(9):1321-1325.

[12]鄭德勇,安鑫南. 竹葉提取物清除DPPH自由基的測定方法[J]. 福建農林大學學報:自然科學版,2005,34(1):59-62.

[13]Yizhong Cai,Qiong Luo,Mei Sun,et al. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 Chinese medicinal plants associated with anticancer[J]. Life Sciences,2004,74(17):2157-2184.

[14]劉愛敬,廖爭爭,郭琳,等. 大孔樹脂純化黃秋葵及其體外抗氧化活性研究[J]. 食品工業科技,2015,36(16):284-288.

Study on purification technology for total flavonoids from the seeds ofiziphusjujubaMill. with macroporous resins andinvitroantioxidant ability

ZHAO Xu1,ZHANG Si-tong1,LIU Chun-mei2,YAN Ting-xu2,XIAO Feng1,JIA Ying1,*

(1.School of Functional Food and Wine,Shenyang Pharmaceutical University,Shengyang 110016,China; 2.School of Traditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shengyang 110016,China)

Study on optimum conditions of the purification of total flavonoids from the seeds ofZiziphusjujubaMill. with macroporous adsorption resin. Meanwhile,to analyze theinvitroantioxidant capacities of the flavonoids. Five different polarity macroporous adsorption resin were selected by using static adsorption and dynamic adsorption tests,and the total flavonoids concentration of sample,sample volume,the volume fraction of the elution,the volume of elution and the flow rate were investigated,respectively. The flavonoids were evaluated by three models of antioxidant activity:·DPPH,ABTS+· and K3Fe(CN)6with VCas the positive control. The results indicated that AB-8 macroporous adsorption resin was selected as the purification of the total flavonoids ofZiziphusjujubaMill. The optimum technology conditions were as follows:the total flavonoids concentration of sample was 1.99 mg/mL,sample volume was 50 mL,the volume fraction of the elution was 50% ethanol,the volume of elution was 50 mL,and the flow rate was 1 mL/min after purification. Compared with VC,the flavonoids fromZiziphusjujubaMill. had stronger capacity of scavenging on ·DPPH,ABTS+·(IC500.70 mg/mL,0.15 mg/mL)and showed a high reduction capacity.

ZiziphusjujubaMill.;total flavonoids;macroporous adsorption resin;invitroantioxidant capacities

2016-06-15

趙旭(1983-)，男，博士，講師，研究方向：中藥藥效物質基礎、體內藥物分析，E-mail：zhaoxu_1010@163.com。

*通訊作者:賈英(1969-)，女，博士，教授，主要從事中藥藥效物質基礎、神經退行性疾病活性成分篩選及中藥干預的研究，E-mail：jiayingsyphu@126.com。

國家自然科學基金(81403065，81573580)；遼寧省教育廳科研項目(L2015533)；遼寧省大學生創新創業訓練計劃項目(201610163050)。

TS201

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000