塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用研究

李 萍,米生權,趙 卓

(北京聯合大學應用文理學院,北京 100191)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用研究

李 萍,米生權,趙 卓*

(北京聯合大學應用文理學院,北京 100191)

為了探討塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用,將L2期秀麗隱桿線蟲暴露于不同濃度DBP(32.5、131、522 mg/L)48 h后,檢測秀麗隱桿線蟲體內總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量的影響。實驗結果表明,隨著DBP濃度升高,線蟲體內MDA含量升高。與對照組相比,522 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內T-SOD和CAT酶活力、GSH含量均極顯著降低(p<0.01)。結論:DBP對秀麗隱桿線蟲產生氧化損傷作用。

秀麗隱桿線蟲,鄰苯二甲酸二丁酯,氧化損傷

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是一種重要的鄰苯二甲酸酯類物質(PAEs),由于性能優良,工藝成熟,價格低廉[1],是工業上常用的增塑劑和軟化劑,多用于輪胎、橡膠、粘合劑和電線外皮等工業生產[2],還用于人工瓣膜的潤滑劑和皮膚軟化劑等醫療領域。由于PAEs與高分子聚合物之間不以共價鍵形式結合,而僅僅以氫鍵或范德華力結合,彼此仍保持獨立的化學結構[3],隨著使用和時間的推移,DBP不斷從塑料材料中逸出,污染空氣、土壤、水源乃至食品,對人類健康造成潛在影響[4]。

DBP的主要毒性是生殖發育毒性,DBP染毒大鼠出現睪丸萎縮和附睪發育不全等雄性生殖系統損害;仔鼠體重增長變緩和睪丸損害等[5]。神經毒性方面,PAEs使雄性大鼠神經細胞核深染固縮,染色質凝結成團,胞漿泡沫樣改變而呈現出一系列神經反射異常現象。同時DBP經口對嚙齒類動物有肝腎毒性作用,主要是通過對其體內的過氧化脂質以及抗氧化酶活力的影響來實現[6]。Tseng等研究發現,DBP誘導秀麗隱桿線蟲行為缺陷,包括身體彎曲,翻轉頻率及趨溫性改變等[7]。目前有關DBP對哺乳動物、浮游生物、節肢動物和魚類毒性作用的研究均有報道,但多集中在生殖毒性、胚胎毒性和發育毒性,本實驗主要研究DBP對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,簡稱C.elegans)是多細胞無脊椎生物,具有結構簡單、遺傳背景清晰、進化高度保守、飼養方便、身體透明、生命周期短、基因可操縱性強等特點,是一種理想的毒理研究模式生物,已發展為應用行為學指標研究化學物神經毒性和生殖毒性的成熟模型[8-9]。由于增塑劑鄰苯二甲酸酯類物質對秀麗隱桿線蟲毒性效應的研究極少,本實驗選擇秀麗隱桿線蟲為動物模型,研究不同濃度DBP對秀麗隱桿線蟲體內總超氧化物歧化酶活力(SOD)等抗氧化酶和抗氧化劑的影響,從而探討DBP對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用,為DBP在功能食品中的應用提供毒理學評價依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌OP50與N2野生型C.elegans中國科學院生物物理研究所惠贈;鄰苯二甲酸二丁酯(DBP 純度:98.0%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜(DMSO 純度:99.0%) 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;SOD試劑盒(測總)、(CAT)可見光試劑盒、(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司等。

XDS-1B型倒置顯微鏡 重慶重光實業有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司;MJ-250F-II型霉菌生化培養箱 上海一恒科技有限公司;5804R型高速離心機 德國Eppendorf公司;UV-2000型紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品板制備 無菌條件下,分別吸取0.3125、1.25和5 mL的鄰苯二甲酸二丁酯于對應離心管中,依次加入DMSO使溶液終體積為10 mL,再依次從中取出0.2 mL樣品溶液于200 mL滅菌融化的NGM培養基中,配制成DBP 濃度為32.5、131、522 mg/L的樣品培養基(DMSO≤0.1%)。再取0.2 mL DMSO于200 mL滅菌融化的NGM培養基中,配制成0.1%DMSO對照組培養基。每個濃度組200 mL NGM培養基平均倒12個平板,其中每6個平板合并為1個平行,即分為2組平行。

在NGM培養基中涂布100μL OP50菌液,于20恒溫培養48 h,待大腸桿菌長出薄薄一層后備用。

1.2.2 線蟲轉接培養 將同步化后L2期蟲子切塊,分別接種到制備好的含樣品和DMSO的培養皿上,每個平板培養線蟲150～200條左右,20恒溫培養48 h[10]。

1.2.3 抗氧化酶、抗氧化劑和MDA指標的檢測 取研磨管4支,標記為DMSO對照組、32.5、131、522 mg/L DBP濃度組,轉移各樣本組線蟲至相應研磨管中,加入PBS使各研磨管中液體總體積為0.5 mL,加入研磨珠適量,組織研磨儀設置為1500 r/min,60 s運行時間,10 s間歇時間,進行3次研磨循環,最后在倒置顯微鏡下取20 μL蟲液觀察線蟲是否研磨充分(研磨管和研磨珠提前在冰上預冷)。若線蟲研磨充分,離心線蟲研磨液,取上清,按照SOD試劑盒(測總)、(CAT)可見光試劑盒、(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒說明書進行測定,并且測定各樣本組蛋白濃度。

1.2.4 數據處理 用SPSS 20.0處理數據,以ANOVA分析方法比較不同組間T-SOD和CAT酶活力、GSH和MDA含量,用OriginPro 9.1作圖。

2 結果與分析

2.1 DBP處理對秀麗隱桿線蟲T-SOD活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是機體重要的抗氧化酶,負責清除機體超氧陰離子自由基,起到抗氧化保護作用。如圖1所示,與對照組相比,131 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內T-SOD酶活力提高(p<0.05),而522 mg/L DBP處理組T-SOD酶活力極顯著降低(p<0.01)。該結果表明,低濃度131 mg/L DBP激活了線蟲體內T-SOD酶活力,而高濃度522 mg/L DBP顯著降低T-SOD酶活力,可能原因為低濃度131 mg/L DBP脅迫激活機體免疫機能,高濃度522 mg/L DBP脅迫產生的氧化壓力超出了機體自我調節能力,使抗氧化酶活性降低,對機體產生氧化損傷。

圖1 不同濃度DBP對線蟲體內總超氧化物歧化酶活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of DBP on the activities of superoxide dismutase in C.elegans注:與DMSO對照組相比,* p<0.05,** p<0.01;圖2～圖4同。

2.2 DBP處理對秀麗隱桿線蟲體內CAT活力的影響

過氧化氫酶(CAT)是機體重要的抗氧化酶,機體細胞呼吸過程中部分氧會被還原為H2O2,H202易被細胞內還原劑還原為強氧化劑·OH自由基,過氧化氫酶能消除由機體代謝產生的H202,阻斷·OH的累積,防止機體氧化損傷。如圖2所示,與DMSO處理組相比,32.5 mg/L和131 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內CAT酶活力均極顯著升高(p<0.01),而522 mg/L DBP處理組CAT酶活力極顯著降低(p<0.01)。該結果表明,低濃度DBP顯著激活了線蟲體內CAT酶活力,而高濃度DBP顯著降低CAT酶活力。

圖2 不同濃度DBP對線蟲體內過氧化氫酶活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DBP on the activities of catalase in C.elegans

圖3 不同濃度DBP對線蟲體內谷胱甘肽含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of DBP on the contents of glutathione in C.elegans

2.3 DBP處理對秀麗隱桿線蟲體內GSH含量的影響

還原型谷胱甘肽(GSH)是機體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑,與自由基、重金屬等結合,具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等生理功能。如圖3顯示,與對照組相比,32.5 mg/L與131 mg/L DBP處理組GSH含量沒有變化(p>0.05)。522 mg/L DBP處理組GSH含量極顯著降低(p<0.01)。

2.4 DBP處理對秀麗隱桿線蟲體內MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是脂質氧化終產物,常用于評價機體脂質過氧化程度和氧化受損傷程度,MDA的含量越大則說明機體氧化損傷越嚴重。如圖4所示,與對照組相比,522 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內MDA含量極顯著升高(p<0.01)。且隨著DBP濃度逐漸增大,MDA含量逐漸升高。以上結果表明,DBP造成線蟲細胞脂質過氧化損傷。

圖4 不同濃度DBP對線蟲體內氧化產物MDA含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of DBP on the contents of MDA in C.elegans

3 討論與結論

本實驗所測T-SOD和CAT為酶抗氧化系統,GSH為非酶抗氧化系統。當機體存在氧化應激壓力時,抗氧化防御系統清除機體產生的活性氧,共同作用保護機體免受氧化損傷;但當抗氧化防御系統不能有效清除機體內過量的自由基時,則導致機體產生氧化損傷,使細胞膜發生脂質過氧化反應,產生大量的MDA[11]。

研究證實,DBP在生物體內代謝過程中可誘發活性氧自由基的大量產生,從而對生物體產生氧化損傷[12]。SOD和CAT是機體內重要的抗氧化酶,SOD將氧自由基轉化成H2O2,CAT進一步分解H2O2為H2O。防止機體氧化損傷。本實驗研究表明,低濃度DBP(131 mg/L)激活T-SOD酶活力,低濃度DBP(32.5 mg/L和131 mg/L)激活CAT酶活力,高濃度DBP(522 mg/L)顯著降低T-SOD和CAT酶活力。低濃度DBP對T-SOD和CAT酶活力影響不同,這可能與兩種酶的受影響模式不同有關,SOD歧化超氧陰離子產生的H202不完全由CAT還原,且細胞色素P450氧化酶激活也可產生H202。王艷[13]研究了幾種鄰苯二甲酸酯對蚯蚓的分子毒性機理,結果表明DBP單一污染對蚯蚓體內CAT酶活性的影響為低濃度激活,隨著DBP濃度的增加,CAT活性逐漸降低。蔡立哲等[14]研究PAHs對菲律賓蛤仔抗氧化酶活性的影響時發現,PAHs對SOD和CAT活性的影響均表現為先誘導后抑制。Pan等[15]實驗過程中發現,低濃度PAHs脅迫下櫛孔扇貝血淋巴SOD活性持續上升,高濃度脅迫下SOD活性表現為先升后降。其可能原因為低濃度DBP脅迫激活機體免疫機能,高濃度DBP脅迫產生的氧化壓力超出了機體自我調節能力,使抗氧化酶活性降低,對機體產生氧化損傷。

GSH是機體重要的抗氧化劑,本實驗研究表明,522 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內GSH含量顯著降低。秦文娟[16]研究鄰苯二甲酸二丁酯對雄性小鼠生殖毒性及氧化損傷作用發現,DBP能使肝臟和睪丸組織受到損傷,引起GSH含量降低,誘導肝臟組織發生脂質過氧化作用,產生MDA。

MDA是脂質過氧化的最終產物,是反映機體脂質過氧化程度和氧化受損傷程度的重要指標[17]。本實驗研究表明,隨著DBP濃度逐漸增大,無論秀麗隱桿線蟲體內SOD和CAT活性被激活還是被抑制,MDA含量逐漸升高,DBP暴露處理可誘導機體細胞脂質過氧化。蔡鳳云[18]等研究鄰苯二甲酸二丁酯對體外大鼠肝臟細胞的氧化損傷作用,結果表明隨著DBP染毒濃度的升高,大鼠肝臟細胞的MDA含量逐漸上升。

綜上所述,DBP具有造成生物體氧化損傷的作用,DBP做為塑料工業的主要增塑劑和軟化劑,是一種已被確定的環境內分泌干擾物,食品中含有DBP將對食用者造成嚴重氧化應激負荷,從而引發多種神經疾病,如記憶功能下降[19],神經反射降低[20]等,尤其對兒童健康危害更加嚴重,使幼兒智力下降,發育畸形[21]等,因此食品中DBP的危害及安全標準應該給予足夠重視,本實驗以抗氧化酶(SOD和CAT)、抗氧化物質(GSH)及氧化產物(MDA)等指標研究DBP的氧化損傷作用,為DBP在功能食品中的應用提供毒理學評價依據。

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2

Study on the oxidative damage effects of dibutyl phthalate inCaenorhabditiselegans

LI Ping,MI Sheng-quan,ZHAO Zhuo*

(College of Applied Arts And Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China)

The aim of this article was to investigate the oxidative damage effect of dibutyl phthalate(DBP)inC.elegans.C.elegansin L2period were expoused to the different concentrations of DBP(32.5,131 and 522 mg/L)for 48 h. Then the activities of T-SOD,CAT and the contents of GSH,MDA inC.eleganswere measured. Results:With increasing DBP concentration,the contents of MDA increased. Compared with the control group,the activities of T-SOD and CAT and the contents of GSH were significantly decreased in 522 mg/L DBP treatment group(p<0.01). These results suggested that DBP could induce the oxidative damage inC.elegans.

Caenorhabditiselegans;dibutyl phthalate;oxidative damage

2016-07-20

李萍(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:營養與慢性病，E-mail:1114176776@qq.com。

*通訊作者:趙卓(1963-), 男，博士，教授, 研究方向: 營養與慢性病, E-mail:zhaozhuo@buu.edu.cn。

北京市教委研究項目資助(SQKM201311417014)；北京市屬高等學校人才強教計劃資助項目(PHR201107150)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000