凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠T淋巴細胞增殖及活性的影響▲

孫朝文 張廣鈺 趙 辰 成懷福 鐘 漓 戴 凌

(1 桂林醫學院附屬醫院胃腸外科，桂林市 541001；2 桂林醫學院研究生學院，桂林市 541004，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

論著·基礎研究

凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠T淋巴細胞增殖及活性的影響▲

孫朝文1，2張廣鈺1趙 辰1，2成懷福1，2鐘 漓1戴 凌1

(1 桂林醫學院附屬醫院胃腸外科，桂林市 541001；2 桂林醫學院研究生學院，桂林市 541004，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

目的 探討凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠T淋巴細胞增殖及活性的影響。方法 (1)取對數生長期大腸癌CT26細胞制備凋亡腫瘤細胞及壞死腫瘤細胞，取Balb/c小鼠脾臟分離T淋巴細胞，并制備細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。(2)將凋亡腫瘤細胞、壞死腫瘤細胞、正常腫瘤細胞分別與小鼠CTL共同培養(分別為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組)，測定CTL的活性及增殖情況。(3)將小鼠T淋巴細胞分為對照組、刀豆蛋白A(ConA)組、凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組，經相應處理后測定各組T淋巴細胞的活性及增殖情況。(4)選取30只Balb/c小鼠分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組各10只，分別將凋亡、壞死、對數生長期CT26細胞通過皮下及靜脈輸注小鼠，檢測各組小鼠血清調節性T細胞(Treg)的表達情況。(5)另取30只小鼠，按方法(4)分組及處理后，測定各組小鼠血清可溶性Fas(sFas)、白細胞介素(IL)-12、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)的表達水平。結果 凋亡腫瘤細胞組中CTL的活性、A450值均低于其他兩組(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞+ConA組的T淋巴細胞CD69、CD25、CD71的表達率以及G2、G3及G4期的T淋巴細胞數量均低于ConA組、活腫瘤細胞+ConA及壞死腫瘤細胞+ConA(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞組Treg的表達水平、sFas相對表達量低于腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞組IL-10、TGF-β表達水平高于其他兩組(P<0.05)，而 IL-12表達水平均低于其他兩組(P<0.05)，IL-4表達水平則高于腫瘤細胞對照組(P<0.05)。結論 凋亡小鼠大腸癌CT26細胞能夠抑制小鼠T淋巴細胞增殖及活性，影響大腸癌小鼠正常免疫功能。

大腸癌；CT26細胞；T淋巴細胞；活性；增殖；調節性T細胞；可溶性Fas；小鼠

大腸癌又稱為結直腸癌，是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率位居全球惡性腫瘤第3位[1]，近年來我國大腸癌的發病率持續上升，現已分別位居男性惡性腫瘤發病第5位和女性惡性腫瘤發病第3位。近年來，雖然在大腸癌治療方面取得巨大進步，然而大腸癌仍是全球癌癥死因的主要原因之一[2]。目前認為大腸癌發生的主要原因是遺傳因素和環境因素[3]，大腸癌患者機體的免疫功能改變主要包括調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)數量增高、腫瘤應答的特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T cell，CTL)活性降低及對腫瘤細胞的免疫耐受，機體免疫監視功能的降低與喪失被認為是大腸癌發生的主要表現。近年來，負載腫瘤抗原的樹突狀細胞(dendritic cells，DC)疫苗被應用于治療腫瘤，從理論上這一方法可以誘導特異性CTL、增強荷瘤機體的免疫功能，但迄今為止，機體對腫瘤的免疫耐受仍然是目前腫瘤免疫治療需要克服的主要障礙[4-7]。盡管腫瘤細胞表達了豐富的“自己”和“異己”抗原，可是表達的這些抗原并沒有引起排斥腫瘤的免疫反應[8-9]。目前凋亡腫瘤細胞導致機體對腫瘤免疫耐受的機制也未明確，因此，本研究分析凋亡大腸癌CT26細胞誘導小鼠對T淋巴細胞增殖及活性的影響，以期為腫瘤免疫治療、建立新的思維方法發展新的腫瘤治療途徑提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物 放線菌素D(美國Sigma公司，生產批號：1102C035)；6%可溶性淀粉肉湯：在100 ml肉湯培養基[北京海淀中海動物保健科技公司，090216(PT-1)]中加入可溶性淀粉6 g，經煮沸滅菌30 min，置4℃冰箱保存備用。

1.2 實驗動物 清潔級6～8周齡Balb/c小鼠70只，雄性，體重(240±30)g，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0015，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。所有小鼠均按無特定病原體級飼養，且所有實驗均通過動物倫理委員會認證。

1.3 細胞株及主要試劑 小鼠結腸癌細胞株CT26，購于中國科學院細胞庫。膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，生產批號：20140331)；胰酶(美國Gibco公司，生產批號：1220087)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma公司，生產批號：141215)；刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A；美國Sigma公司，生產批號：11028-71-0)；熒光染料羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE；美國Molecular Probes公司，生產批號：11348)等；酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，生產批號：130422)等。

1.4 儀器 CO2培養箱(Thermo Forma公司，型號：311)，雙人超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司，型號：BCM-1000)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus，型號：CKX-31)，離心機(德國Eppendorf，型號：Centrifuge 5415R)，移液槍(芬蘭百得公司，型號：Genex，規格：20～200 μl)，BL-420生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司，型號：BL-420S)等。

1.5 方法

1.5.1 CT26細胞的培養及凋亡、壞死腫瘤細胞的制備：將CT26細胞用含10%胎牛血清(美國Gibco公司，生產批號：14000-044)的RPMI-1640培養基(美國Gibco公司，生產批號：120917)培養于5% CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。通過取對數生長期CT26細胞接種于6孔板中，調整密度為1×106細胞/孔。待細胞貼壁后加入含放線菌素D(200 ng/ml)的培養基培養12 h誘導凋亡，用胰酶消化，收集懸液并依次加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI；美國Sigma公司，生產批號：20120811)，混勻后室溫避光孵育15 min后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，富集，按不同濃度稀釋備用。另取對數生長期CT26細胞用加熱法(腫瘤細胞株56℃水浴1 h)制備壞死腫瘤細胞，顯微鏡下觀察細胞的壞死形態改變并確定，臺盼藍拒染法檢測細胞死亡率，按不同濃度稀釋(取0.5 ml臺盼藍溶液、0.3 ml Hanks或者PBS和0.2 ml細胞懸液，充分混勻，或者0.4%的臺盼藍與制好的細胞懸液等體積混合)，然后將混合液放置5～15 min備用。

1.5.2 T細胞亞群、CTL的制備及CTL分組：適應性喂養5～6 d后，取6～8周齡雄性Balb/c小鼠10只，適應性喂養5～6 d后再正常喂養3 d后，脫頸椎處死，取脾臟，去被膜，于200目不銹鋼網過濾，800 r/min離心4 min，收集待分離細胞，將細胞懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，采用免疫磁珠分選法分離T細胞亞群，通過流式細胞儀鑒定其表型，分選出的陽性細胞用熒光標記的相應抗體通過熒光激活細胞分離法鑒定純度。將T淋巴細胞與凋亡腫瘤細胞按25 ∶1比例混勻，靜置于培養箱中共培養，4 d后半量換液，繼續培養3 d。第2周起，每周加比例為10 ∶1的凋亡細胞1次，共3次。其中在第2次的第3天加入白細胞介素(interleukin，IL)-2(終濃度20 U/ ml)，并每隔3～4 d更換1次培養基。在第2次結束后，1 500 r/min離心15 min，收集細胞，即特異性CTL，計數、調整至合適濃度。將小鼠CTL分別經相應腫瘤細胞處理后分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組3個亞組。(1)凋亡腫瘤細胞組：先將CTL與凋亡腫瘤細胞在96孔培養板內共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入凋亡腫瘤細胞繼續孵育至4 h。(2)壞死腫瘤細胞組：先將CTL與壞死腫瘤細胞在96孔培養板內共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入壞死腫瘤細胞繼續孵育至4 h。(3)腫瘤細胞對照組：CTL與正常腫瘤細胞以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)在96孔培養板內孵育至4 h。

1.5.3 免疫細胞活性檢測：采用51 Cr 釋放實驗測定3組CTL免疫細胞活性，其中以相應腫瘤細胞為靶細胞并預先以Na251CrO4標記，CTL細胞為效應細胞。各組同時設自然釋放對照孔及最大釋放對照孔。分別取每組各孔上清，用γ計數儀測量放射活性值(單位：cpm)。根據下式計算51Cr自然釋放率和CTL活性：

1.5.4 免疫細胞增殖檢測：采用細胞計數(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測鼠的CTL淋巴細胞增殖情況。分別將凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組中的CTL與對數生長期的CT26細胞按25 ∶1比例混勻鋪96孔板，細胞重懸成單細胞懸液，每孔1×103個細胞，100 μl培基，每組3個復孔，96孔板邊上一圈的孔不鋪細胞，只加PBS用于調零。將培養板靜置于37℃，5% CO2培養箱內共培養72 h，終止培養前2 h加入每孔加入10 μl的CCK-8試劑(上海碧云天生物技術有限公司，生產批號：20120503)，繼續將培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A值)，計算細胞增殖活性。

1.5.5 流式細胞儀檢測：(1)將小鼠T淋巴細胞不同亞群用CFDA-SE進行染色后，分為對照組、ConA組、凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組，其中凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組分別與凋亡、壞死、活腫瘤細胞共培養2 h，然后于ConA組、凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組培養基中加入Con A繼續培養48 h后取出，流式細胞術檢測不同周期T淋巴細胞的增殖情況。(2)將小鼠不同亞群T淋巴細胞分為對照組、ConA組、凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組，其中凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組分別與凋亡、壞死、活腫瘤細胞共培養2 h，然后于ConA組、凋亡腫瘤細胞+ConA組、壞死腫瘤細胞+ConA組、活腫瘤細胞+ConA組培養基中加入ConA繼續培養36 h，分別于12 h和36 h取出，洗滌，去上清，加入相應標記單克隆抗體(CD69抗體、CD25抗體、CD71抗體)，用流式細胞儀檢測各組T淋巴細胞活化標記分子CD69、CD25、CD71的表達。(3)選取6～8周齡雄性Balb/c小鼠30只，采用隨機數字表法分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組各10只，通過皮下及靜脈分別注射凋亡、壞死、對數生長期的CT26細胞，其中皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，靜脈注射采用1～3 ml的注射量輸注入小鼠。采用三色標記技術、流式細胞儀檢測各組小鼠血清Treg表達情況。取小鼠外周靜脈血4 ml以乙二胺四乙酸抗凝，充分混勻。取10 ml離心管，將4 ml全血緩慢加在4 ml淋巴細胞分離液上部，2 000 r/min室溫離心20 min。輕輕吸取中間白色淋巴細胞層至另一管，2 000 r/min室溫離心5 min，去上清。加2 ml PBS混勻，2 000 r/min室溫離心5 min，去上清。計數細胞后調整細胞濃度至1×106/ml。取200 μl上述單細胞懸液，在對照管和實驗管中分別加入100 μl，且在兩管中均加入直接熒光標記的鼠抗人特異性單抗、直接熒光標記的鼠抗人特異性單抗各5 μl，4℃避光孵育30 min。加流式細胞術染色緩沖液，混勻。2 000 r/min室溫離心5 min，去上清。對照管和實驗管中各加入2 ml破膜劑。4℃避光孵育45～60 min。2 000 r/min，離心5 min，去上清。對照管和實驗管中各加入2 ml通透緩沖液，2 000 r/min，室溫離心5 min，去上清。重復通透緩沖液洗細胞步驟1次。對照管和實驗管各加入100 μl通透緩沖液，充分混勻，再加正常大鼠血清2 μl，4℃避光孵育15 min。無需通透緩沖液清洗細胞，直接在對照管中加入免疫球蛋白G1-綠膿桿菌外毒素2.5 μl，實驗管中加入Foxp3-綠膿桿菌外毒素20 μl。4℃避光孵育至少30 min。對照管和實驗管中各加入2 ml通透緩沖液，2 000 r/min室溫離心5 min。去上清，重復通透緩沖液清洗步驟一次。加400 μl通透緩沖液上機檢測。

1.5.6 ELISA檢測免疫因子表達水平：選取6～8周齡雄性Balb/c小鼠30只，采用隨機數字表法分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組各10只，通過皮下及靜脈分別注射凋亡、壞死、對數生長期的CT26細胞，其中皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，靜脈注射采用1～3 ml的注射量輸注入小鼠。經尾靜脈采血約500 μl，待血自然凝固后，5 963 r/min離心10 min，吸取血清分裝凍存于-70℃冰箱內，避免反復凍融。采用ELISA嚴格按照操作說明書進行檢測血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10、IL-12、轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)水平。測定標本A450值，以標準品濃度作橫坐標，A值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點，通過標本的A值可在標準曲線上查出其濃度。

1.6 統計學分析 應用SPSS 18.0軟件進行統計學處理。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗或q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同狀態腫瘤細胞對小鼠體外CTL活性的影響 3組51Cr自然釋放率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。凋亡腫瘤細胞組中CTL不同效靶比的CTL活性均低于其他兩組(P<0.05)，見表1。

表1 不同狀態腫瘤細胞對 小鼠體外CTL活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細胞組比較， △P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

2.2 不同狀態腫瘤細胞對小鼠體外CTL增殖的影響 凋亡腫瘤細胞組CTL的A450值低于其他兩組(P<0.05)，見表2。

表2 不同狀態腫瘤細胞 對小鼠體外CTL增殖的影響(x±s)

注：與壞死腫瘤細胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

2.3 不同狀態腫瘤細胞對ConA誘導的小鼠體外T淋巴細胞活化的影響 凋亡腫瘤細胞+ConA組T淋巴細胞CD69、CD25、CD71的表達率低于ConA組、活腫瘤細胞+ConA及壞死腫瘤細胞+ConA(P<0.05)，高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 不同狀態腫瘤細胞對 ConA誘導T細胞體外活化表達率的影響(x±s，%)

注：與凋亡腫瘤細胞+ConA組比較，*P<0.05。

2.4 不同狀態腫瘤細胞對ConA誘導的小鼠體外T淋巴細胞增殖的影響 CFDA-SE染色后可見凋亡腫瘤細胞組G2、G3及G4期的T淋巴細胞數量均低于ConA組、活腫瘤細胞+ConA及壞死腫瘤細胞+ConA(P<0.05)，3組增殖指數(proliferation index，PI)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同狀態腫瘤細胞對ConA誘導的T細胞增殖影響(x±s，%)

注：與凋亡腫瘤細胞+ConA組比較，*P<0.05。

2.5 不同狀態腫瘤細胞對小鼠Treg表達的影響 凋亡腫瘤細胞組的Treg的表達低于腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組(P<0.05)，見表5。

表5 不同狀態腫瘤細胞對小鼠Treg表達的影響(x±s，%)

注：與凋亡腫瘤細胞比較，*P<0.05。

2.6 不同狀態腫瘤細胞對對小鼠血清sFas、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響 凋亡腫瘤細胞組sFas相對表達量低于壞死腫瘤細胞組和正常腫瘤細胞細胞(P<0.05)，而壞死腫瘤組sFas相對表達量則高于腫瘤細胞對照組(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞組抗炎因子IL-10、TGF-β表達水平高于腫瘤細胞對照組與壞死腫瘤細胞組(P<0.05)，IL-4表達水平則高于腫瘤細胞對照組而低于壞死腫瘤細胞組(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞組促炎因子IL-12表達水平均低于正常腫瘤細胞與壞死腫瘤細胞(P<0.05)。見表6。

表6 ELISA法檢測不同狀態腫瘤細胞對小鼠血清sFas、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響(x±s)

注：△指與壞死腫瘤細胞組比較，P<0.05；#指與凋亡腫瘤細胞組比較，P<0.05。

3 討 論

Kerr于1972年首次提出，細胞凋亡是一種細胞正常生理現象下發生的程序性死亡，能將無功能細胞進行非炎癥性清除，對于機體發揮免疫功能具有極其重要的作用[10]。機體通過凋亡的形式阻止免疫應答的發生，而免疫細胞通過吞噬凋亡細胞從而加強或抑制機體的免疫應答[11]。在細胞凋亡的早期階段，凋亡細胞釋放“find-me”信號以被吞噬細胞識別[12]，從而吸引這些吞噬細胞接近凋亡細胞。接著凋亡細胞胞膜結構發生變化，表達“find-me”信號[13]，如磷脂酰絲氨酸的反轉表達[14]等，引起周圍組織中具有吞噬作用的細胞迅速識別并對其進行吞噬，凋亡細胞被接觸和(或)吞噬后，吞噬細胞內發生一系列特殊的變化，引起一些炎性因子的表達降低，如粒細胞集落刺激生物因子[15]、腫瘤壞死因子-α、IL-4等，而前列腺素E2、血小板活性化因子等抗炎因子表達和分泌水平提高，使吞噬細胞表達抗炎表型，發揮抑制炎性反應的作用。Liu等[16]認為凋亡細胞被專職的吞噬細胞識別而激發抗炎反應，下調炎癥因子水平。細胞凋亡參與免疫系統的調節，誘導機體發生免疫耐受。有研究表明，細胞凋亡能保持機體免疫系統的平衡和穩定，發揮免疫調節的作用[17]。陳建鋒等[18]認為，細胞凋亡可能抑制機體局部的炎癥反應，誘導免疫耐受。本次實驗旨在通過用多種實驗方法來驗證凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠體外T淋巴細胞及其活性的抑制作用。

51Cr釋放實驗結果顯示， 凋亡腫瘤細胞組中CTL的51Cr自然釋放率、不同效靶比的CTL活性均低于壞死腫瘤細胞組及腫瘤細胞對照組(P<0.05)，提示凋亡大腸癌CT26細胞培養的免疫細胞活性受到抑制。而用CCK-8檢測結果顯示，凋亡腫瘤細胞組CTL的A450值也低于其他兩組(P<0.05)，提示凋亡大腸癌CT26細胞能夠抑制小鼠的CD8+T淋巴細胞增殖。ConA具有強力的促有絲分裂、促淋巴細胞轉化反應的作用，能選擇性激活被抑制的T淋巴細胞。由于ConA是T淋巴細胞分裂原，本實驗采用ConA進行誘導干預作用，在細胞培養時加入ConA能夠促進細胞活化增殖，誘導細胞分裂，進而觀察不同狀態腫瘤細胞對ConA誘導的小鼠體外T淋巴細胞活性及增殖的影響，判斷細胞免疫的功能狀態，結果顯示，凋亡腫瘤細胞+ConA組T淋巴細胞CD69、CD25、CD71的表達率以及G2、G3及G4期的T淋巴細胞數量仍均低于ConA組、活腫瘤細胞+ConA及壞死腫瘤細胞+ConA(P<0.05)。

ELISA檢測顯示凋亡腫瘤細胞組CT26細胞的sFas相對表達量明顯低于壞死腫瘤細胞組和腫瘤細胞對照組(P<0.05)，其亦對小鼠血清IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β表達水平產生影響，其中與正常腫瘤細胞組與壞死腫瘤細胞組比較，凋亡腫瘤細胞組抗炎因子IL-10、TGF-β表達水平升高，促炎因子IL-12表達水平降低(P<0.05)，IFN-γ水平也降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，此外抗炎因子IL-4表達水平也高于腫瘤細胞對照組(P<0.05)。提示凋亡中或者即將啟動凋亡的腫瘤細胞中sFas及相關免疫抗炎因子表達水平上升，促炎因子下降，這也從另一角度反映炎癥反應得到了抑制。Sakaguchi等[19]研究發現Treg在局部造成的免疫抑制微環境是幫助腫瘤細胞逃避免疫殺傷的關鍵。因此CD8+T和IFN-γ也是反映Treg免疫抑制狀態的重要間接指標。本研究中，IFN-γ水平變化不甚明顯的原因可能是實驗誤差、未多次重復實驗等。Fas配體能夠抑制細胞凋亡，但在已經發生凋亡的腫瘤細胞中卻能發揮抑制T淋巴細胞的活性甚至低效誘導T淋巴細胞凋亡。在此基礎上其可能同時誘導中性粒細胞趨化，進而導致機體出現免疫耐受。

此外，本實驗也進行了流式細胞儀檢測不同狀態腫瘤細胞對小鼠Treg表達情況，結果顯示凋亡腫瘤細胞組Tregs的表達均較壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組明顯減弱(P<0.05)，這提示在活體小鼠體內凋亡的CT26細胞可抑制小鼠免疫系統的Treg表達。目前，對于Treg誘導的免疫抑制狀態與CT26模型小鼠腫瘤的影響作用有許多新的觀點。Tanaka等[20]研究認為，已凋亡細胞提供了豐富的抗原從而使機體建立起外周免疫耐受，而King等[21]認為腫瘤細胞會抑制細胞凋亡特別是對腫瘤細胞自身的凋亡刺激，兩者的結論有本質區別。DC通過吞噬負載抗原的凋亡細胞而誘導免疫耐受，未成熟的DC細胞能遞呈凋亡信號至抗原特異性T細胞，從而抑制T細胞的增殖，這表明在體內凋亡的誘導能導致抗原特異性耐受，很有可能通過DC和Treg介導[22]。凋亡細胞導致免疫耐受，這在大鼠心臟移植、C57/B1/6小鼠脾分離及與小鼠脾源性淋巴細胞共培養等實驗中得到證實[23-26]。而我們的研究結果也提示凋亡的凋亡大腸癌CT26細胞無論在體外還是在活體小鼠體內都可抑制T淋巴細胞的增殖和活性。當機體固有免疫系統功能受到抑制時，炎性因子的活性受到影響，可能成為誘導機體對腫瘤細胞產生免疫耐受的重要環節。

那么凋亡CT26細胞是通過增加了抗腫瘤的效應而對抗 Treg的免疫抑制亦或是抑制了Treg的功能而發揮了抗腫瘤效應呢？ Shi等[27]認為Treg通過分泌TGF-β和IL-10以抑制免疫反應，而Dash等[28]認為TGF-β影響Treg的轉錄和擴增，且IL-10與小鼠 Treg的數量和功能緊密相關。在本實驗中，凋亡腫瘤細胞組Tregs降低，其血清中TGF-β和 IL-10 表達水平增高，提示凋亡CT26細胞抑制外周血中Treg分泌IL-10的能力，表明凋亡CT26細胞有抑制Treg免疫調節的作用，而阮志燕等[29]認為大黃素能抑制CT26結腸癌小鼠Treg的生物學功能，其通過影響Treg的免疫抑制功能而發揮抗腫瘤作用，這與我們的結論有相似之處。

綜上所述，凋亡小鼠大腸癌CT26細胞能夠抑制小鼠T淋巴細胞增殖及其活性表達，影響大腸癌小鼠正常免疫功能。盡管目前對與凋亡CT26細胞的作用靶點尚不清楚， 但是其對 Treg的抑制作用在本實驗中得到進一步證實。因此，我們認為凋亡的大腸癌CT26細胞也能像正常細胞一樣抑制機體免疫調節，抑制T淋巴細胞的增殖和活性，這意味著凋亡腫瘤細胞也可以像正常細胞凋亡時那樣誘導機體發生免疫耐受。但是本實驗對于凋亡CT26細胞抑制小鼠T淋巴細胞增殖及其活性的具體機制沒有展開深入研究，實驗中部分實驗結果無統計學意義可能是樣本數不足、儀器測量誤差等原因引起，應當在后續研究中進一步分析與驗證。

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Effect of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on proliferation and activity of T lymphocytes in mice

SUNChao-wen1,2,ZHANGGuang-yu1,ZHAOChen1,2,CHENGHuai-fu1,2,ZHONGLi1,DAILing1

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China;2GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To investigate the effect of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on the proliferation and activity of T lymphocytes in mice.Methods ① Colorectal cancer CT26 cells during logarithmic growth phase were used to prepare apoptotic tumor cells and necrotic tumor cells.T lymphocytes were isolated from the spleens of Balb/c mice,and then cytotoxic T lymphocytes(CTL) were prepared.② The apoptotic tumor cells,necrotic tumor cells and normal tumor cells were cultured with murine CTL separately(taken as apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,respectively).Then the activity and proliferation of CTL were detected.③ The T lymphocytes of mice were divided into control group,concanavalin A(ConA) group,apoptotic tumor cell+ConA group,necrotic tumor cell+ConA group and living tumor cell+ConA group.The activity and proliferation of T lymphocyte in each group were detected after corresponding treatment.④ Thirty Balb/c mice were selected and divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,with 10 mice in each group.Apoptotic CT26 cells,necrotic CT26 cells and CT26 cells during logarithmic growth phase were subcutaneously and intravenously infused into mice in corresponding groups.Then the expression of regulatory T cells (Treg) in each group was detected.⑤ Another 30 mice were selected,then were grouped and treated by the way of method ④.The expression levels of soluble Fas(sFas),interleukin(IL)-12,interferon gamma(IFN-γ),IL-4,IL-10 and transforming growth factor beta(TGF-β) in each group were detected.Results The activity andA450 value of CTL in the apoptotic tumor cell group were lower than those in the other two groups(P<0.05).The expression rates of T lymphocytes(including CD69,CD25 and CD71) and number of T lymphocytes during stage G2 or G3 in the apoptotic tumor cell+ConA group were lower than those in the ConA group,living tumor cell+ConA group and necrotic tumor cell+ConA group(P<0.05).The expression level of Treg and relative expression of sFas in the apoptotic tumor cell group were lower than those in the tumor cell group and necrotic tumor cell group(P<0.05).The expression levels of IL-10 and TGF-β were higher and the expression level of IL-12 was lower in the apoptotic tumor cells group compared with the other two groups(P<0.05).The expression level of IL-4 in the apoptotic tumor cells group was higher than that in the tumor cell control group(P<0.05).Conclusion Apoptotic colorectal cancer CT26 cells can inhibit the proliferation and activity if T lymphocytes in mice,and can affect the normal immunological function of mice with colorectal cancer.

Colorectal cancer,CT26 cells,T lymphocytes,Activity,Proliferation,Regulatory T cell,Soluble Fas,Mouse

廣西自然科學基金(2012GXNSFAA276035)；廣西桂林市科學研究與技術開發計劃(20120121-1-13)

孫朝文(1988～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創外科。

張廣鈺(1966～)，男，碩士，主任醫師，教授，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創外科，E-mail：acrosssky@126.com。

R 735.3；R 392.4

A

0253-4304(2016)09-1201-07

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.04

2016-06-20

2016-07-25)