結核感染T細胞斑點試驗在輔助診斷骨結核中的應用價值▲

吳 青 呂 幸 李 艷 徐萬洲 龔衛(wèi)杰 吳澤剛 蔡 璇

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，武漢市 430060，E-mail：306823560@qq.com)

論著·臨床研究

結核感染T細胞斑點試驗在輔助診斷骨結核中的應用價值▲

吳 青 呂 幸 李 艷 徐萬洲 龔衛(wèi)杰 吳澤剛 蔡 璇

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，武漢市 430060，E-mail：306823560@qq.com)

目的 探討結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)在輔助骨結核診斷中的應用價值。方法 回顧性分析137例疑似骨結核患者的臨床資料，根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學檢查、組織病理學檢查、病原學檢查結果以及臨床抗結核治療效果進行診斷，確認或臨床診斷骨結核患者69例，非骨結核患者68例。所有患者治療前均行結核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)試驗及T-SPOT.TB，分析T-SPOT.TB在輔助診斷骨結核中的效能。結果 T-SPOT.TB輔助診斷骨結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為98.5%、91.2%、91.9%、98.4%，均高于TB-PPD試驗輔助診斷骨結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值的50.7%、77.9%、70.0%、60.9%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 T-SPOT.TB可輔助診斷骨結核，其具有較高的診斷敏感性、特異性。

骨結核；結核感染T細胞斑點試驗；結核菌素純蛋白衍生物試驗；輔助診斷

骨關節(jié)是肺外結核的高發(fā)部位，骨關節(jié)結核約占肺外結核的30%以上[1-3]。骨結核的早期臨床癥狀、影像學表現(xiàn)均不明顯，確診需要感染組織活檢檢出結核分枝桿菌，而結核分枝桿菌的培養(yǎng)不僅取材困難，耗時長且陽性率僅有60%～80%[4]。因此，如何在早期診斷骨結核已成為臨床的迫切需求[5]。近年來，一種新的早期診斷方法—結核感染T細胞斑點試驗(T-cell spot test for tuberculosis infection，T-SPOT.TB)已被廣泛應用于結核病的診斷等方面[6-8]。T-SPOT.TB 通過檢測致敏T淋巴細胞表達的早期分泌靶抗原-6(early secreting antigenic target-6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白-10(culture filtrate protein-10，CFP-10)間接檢測結核感染。抗原ESAT-6和CFP-10的編碼基因位于結核分枝桿菌基因差異區(qū)1，該基因在大多數(shù)非結核分枝桿菌中缺失，因此具有較高的特異性。本文主要探討T-SPOT.TB在輔助診斷骨結核中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年8月至2016年4月湖北省人民醫(yī)院收治的疑診骨結核患者137例，男72例，女65例，年齡12個月至87歲[(53.47±1.75)歲]；有卡介苗接種史135例(98.5%)，合并肺結核或肺結核病史17例(12.4%)，糖尿病史7例(5.1%)，器官移植史1例(0.7%)，合并惡性腫瘤4例(2.9%)、重癥肝炎5例(3.6%)、慢性腎病3例(2.2%)。根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學檢查、組織病理學檢查、病原學檢查結果以及臨床抗結核治療效果等信息進行診斷分組。若患者病變部位樣本中檢出結核分枝桿菌則為確診結核；若患者組織學改變符合肉芽腫性炎或干酪樣壞死且抗結核治療有效則為臨床診斷結核；若診斷為其他疾病或抗結核治療癥狀無明顯改善則為排除結核。結果骨關節(jié)結核組69例(其中確診26例及臨床診斷骨結核43例)，其中脊柱結核37例、膝關節(jié)12例、手掌關節(jié)3例、肘關節(jié)4例、髖關節(jié)18例；排除骨關節(jié)結核的患者68例。

1.2 結核菌素純蛋白衍生物試驗 應用北京祥瑞生物制品有限公司生產(chǎn)的結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，TB-PPD；5支/盒，每支1 ml，國藥準字：S10960018)，于患者前臂掌側皮內(nèi)注射TB-PPD[0.1 ml(2 U)]，72 h后觀察注射部位皮膚的反應情況。結果判斷參照《中國結核病防治規(guī)劃實施工作指南》(2008版)標準[9]：硬結直徑<5 mm為陰性(-)；5～9 mm為弱陽性；10～20 mm為陽性；>20 mm或局部出現(xiàn)水泡、淋巴管炎、壞死等為強陽性。陽性結果包括弱陽性、陽性和強陽性。檢測均在患者治療前進行。

1.3 T-SPOT.TB 收集患者新鮮肝素抗凝全血5～10 ml，在4 h內(nèi)分離，按1 ∶1等比例與室溫預熱的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，按2～3 ∶1比例小心將血樣加在Ficoll淋巴細胞分離液上層，注意不能將血樣與分離液混合。在18℃，相對離心力1 000 g，離心22 min。將單核細胞層從分離管中轉移到新的無菌的15 ml尖底離心管。外周血單核淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，將分離的PBMCs按試劑盒說明(T-SPOT.TB，Oxford Immunote Ltd，Abingdon，英國)(24人份/盒，批號：013)加入預包被抗人-γ干擾素抗體的板孔中(每孔約2.5×105個PBMCs，每個樣品加4個板孔)，再往4個已加樣板孔中分別加入陰性對照試劑(細胞培養(yǎng)液)、兩種抗原(ESAT-6，CFP-10)及陽性對照，并置于37℃、5% CO2、保持一定濕度培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗和底物顯色后，洗板后對斑點進行計數(shù)。結果判定：抗原ESAT-6或CFP-10板孔中任意1孔點數(shù)-對照孔點數(shù)≥6即為檢測陽性，點數(shù)<6為陰性。檢測均在患者治療前進行。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，分別計算T-SPOT.TB和TB-PPD試驗的敏感度、特異性、陽性預測值、陰性預測值，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

T-SPOT.TB診斷骨結核的敏感度、特異度、陽性預測值以及陰性預測值均高于TB-PPD試驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1～3。

表1 T-SPOT.TB診斷結果

表2 TB-PPD試驗結果

表3 T-SPOT.TB與TB-PPD

3 討 論

近年來，雖然經(jīng)濟發(fā)展快速、居住環(huán)境改善、結核檢測和治療方法不斷進步，但結核的發(fā)病率卻居高不下，肺外結核的發(fā)病率也隨之升高[10]。骨結核作為肺外結核的重要組成部分，因其進展緩慢、臨床表現(xiàn)無特異性，且常導致患者的骨關節(jié)被實質(zhì)性破壞、預后差，給臨床診斷和治療帶來極大的挑戰(zhàn)[11]，如何早期診斷骨結核則成為了臨床棘手的問題。結核感染的確診需要病原微生物學的證據(jù)，然而結核培養(yǎng)需要4～6周才能獲得結果。TB-PPD試驗作為一個快速、簡便、低成本的篩查方法，成為目前臨床上診斷結核感染的常用方法。但此方法不僅受卡介苗接種的影響且與患者的免疫力狀態(tài)有關，其檢測的敏感度、特異度均有限[12]。本研究結果也顯示，TB-PPD試驗輔助診斷骨結核的敏感度僅為50.73%，特異度為77.94%。

T-SPOT.TB作為一種新型快速的免疫性診斷方法，整個檢測過程僅需2 d，目前已被用于肺結核和肺外結核的診斷[13-14]。本研究旨在評價T-SPOT.TB在輔助診斷骨結核中的價值，結果顯示T-SPOT.TB的敏感度為98.551%，特異度為91.176%，提示T-SPOT.TB可作為輔助診斷骨結核的有效方法。

本研究的74例T-SPOT.TB陽性患者中，有6例臨床排除活動性骨結核的診斷。由于T-SPOT.TB反映的是體內(nèi)結核分枝桿菌的存在與否，不能鑒別活動性結核與結核潛伏感染[15]，因此T-SPOT.TB陽性而臨床排除結核診斷可能與結核的潛伏感染或既往有結核病史有關。另外，本研究中有1例臨床組織病理活檢發(fā)現(xiàn)肉芽腫性炎和干酪樣壞死，而T-SPOT.TB呈陰性，最終證實為非結核分枝桿菌感染。這提示T-SPOT.TB可能可用于結核分枝桿菌感染和非結核分枝桿菌感染的初步鑒別診斷，但仍需大樣本量的進一步研究證實。

綜上所述，T-SPOT.TB在骨關節(jié)結核診斷中有較高敏感度、特異度，明顯優(yōu)于TB-PPD試驗，且檢測時間短、取材方便，是輔助診斷骨結核的可靠方法，值得臨床推廣。

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Application value of T-cell spot test for tuberculosis infection in auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis

WUQing,LYUXing,LIYan,XUWan-zhou,GONGWei-jie,WUZe-gang,CAIXuan

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To explore the application value of T-cell spot test for tuberculosis infection(T-SPOT.TB) in the auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis.Methods Clinical data of 137 patients suspected as skeletal tuberculosis were retrospectively analyzed.The patients were diagnosed according to clinical manifestation,the results of imaging examination,histopathological test and pathogen test,and clinical efficacy of antituberculosis.Of 137 patients,69 were definitely or clinically diagnosed as skeletal tuberculosis,and 68 as non-skeletal tuberculosis.All patients received both purified protein derivative of tuberculin(TB-PPD) test and T-SPOT.TB before treatment.The efficacy of T-SPOT.TB for auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis was analyzed.Results The sensitivity,specificity,positive predictive value,and negative predictive value of T-SPOT.TB for auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis were higher than those of TB-PPD test,respectively(98.5%vs. 50.7%,91.2%vs. 77.9%,91.9%vs. 70.0%,and 98.4%vs. 60.9%,allP<0.05).Conclusion T-SPOT.TB can be applied to the auxiliary diagnosis of skeletal tuberculosis for its high diagnostic sensitivity and specificity. 【Key words】 Skeletal tuberculosis,T-cell spot test for tuberculosis infection,Purified protein derivative of tuberculin,Auxiliary diagnosis

國家臨床重點專科建設項目(財社2010305)

吳青(1985～)，女，博士，主管技師，研究方向：感染性疾病致病機制和檢測技術檢測研究。

李艷(1961～)，女，博士，主任技師，研究方向：感染性疾病檢測研究，E-mail：yanlitf1120@163.com。

R 529.21

A

0253-4304(2016)12-1649-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.06

2016-07-25

2016-09-20)