不同組織源性干細胞向神經(jīng)細胞分化的研究進展*

陳龍　李坤正　肖宗宇

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不同組織源性干細胞向神經(jīng)細胞分化的研究進展*

陳龍①李坤正②肖宗宇②

【摘要】隨著神經(jīng)干細胞（NeuralStemCells，NSCs）理論的提出，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的替代治療有了廣闊的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)證實，許多組織中均存在干細胞，但是根據(jù)干細胞的組織來源不同，其向神經(jīng)細胞分化的能力也有差異。本文就近幾年來不同組織來源的干細胞向神經(jīng)細胞分化的研究進展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)干細胞；分化；干細胞；研究進展

①青海大學(xué)青海西寧810000

②青海大學(xué)附屬醫(yī)院

干細胞（StemCells，SCs）是指具有無限的自我更新能力和多向分化潛能的一類細胞，具有廣泛的臨床治療應(yīng)用價值。隨著干細胞理論的提出，為腦梗死、亨廷頓病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞移植治療帶來了新的希望。對于干細胞的替代治療，最早提出的是利用神經(jīng)干細胞（Neural StemCells，NSCs）進行替代，但NSCs取材困難，且存在著較多的倫理學(xué)問題，于是不少學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向了其他干細胞。目前，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)組織中均存在干細胞，根據(jù)其部位不同可分別命名為胚胎干細胞（EmbryonicStemCells，ESCs）、骨髓間充質(zhì)干細胞（BoneMarrowMensenchmalStem Cells，BMSCs）、臍帶血間充質(zhì)干細胞（Umbilical MensenchmalStemCells，UMSCs）、 脂 肪 干 細 胞（AdiposeTissueStemCells，ATSCs）以及外周血干細胞（PeripheralBloodStemCells，PBSCs）。本文就近些年來不同組織源性干細胞向神經(jīng)細胞分化情況作一綜述。

1　神經(jīng)干細胞

神經(jīng)干細胞（NSCs）是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)的、具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的一類細胞。其在神經(jīng)系統(tǒng)中主要作為一種儲備細胞，即當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，如急性缺血性腦梗死、神經(jīng)退行性疾病等，這些干細胞便開始增殖、遷移及分化為相應(yīng)的組織細胞，以便實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的代償。NSCs不僅存在于哺乳動物的胚胎時期，同時也存在于成年動物的腦組織內(nèi)。其進一步分化可形成神經(jīng)祖細胞（progenitor）、膠質(zhì)前體細胞（precursor）及相應(yīng)的神經(jīng)元（Neuron），但是物理或化學(xué)環(huán)境的不同，其向神經(jīng)細胞分化的能力也不同。Zhao等［1］將小鼠神經(jīng)前體細胞（NeuralPrecursorCells，NPCs）置于含20ng/mLEGF、10ng/mLbFGF、0.73U/mL肝素的無血清培養(yǎng)基（SFMC）中培養(yǎng)，第9天時發(fā)現(xiàn)NPCs分化為星形膠質(zhì)細胞（astrocyte）、少突膠質(zhì)細胞（oligodendrocyte）及神經(jīng)元（Neuron）的比例分別為（59.4±3.6）%、（8.7±0.6）%及（8.2±2.2）%；隨后在該分化條件下施加一直流電場（115v/m），實驗組為施加連續(xù)2d的電場，持續(xù)2h/d，對照組未施加電場，培養(yǎng)第9天時發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組Nestin陽性比例分別為（13.6±2.0）%、（30.8±5.2）%，Nestin陽性比例下降提示施加一直流電場后顯著提高了NSCs的分化效率，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，在分化所得的神經(jīng)細胞中，實驗組與對照組中β-tubulinⅢ的表達分別為（16.9±5.3）%和（8.2±2.2）%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而GFAP及Olig2方面比較差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示該直流電場可以促進NSCs向神經(jīng)元方向分化，而對于星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞則無明顯影響。此外，物理性因素對干細胞分化也有一定程度的影響［2］。Arulmoli等［3］在誘導(dǎo)成年大鼠NSCs分化時，通過硅酮彈性體薄膜向NSCs施加適當?shù)臓恳ΓY(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞方向的分化并未受到明顯的影響，而向少突膠質(zhì)細胞方向的分化明顯減少，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），提示機械牽引可以降低NSCs向少突膠質(zhì)細胞的分化。盡管對于NSCs的研究已取得很大的成果，但就目前而言，干細胞移植仍然存在著諸多的問題亟待解決，主要包括：（1）如何讓干細胞在體外完整的保存，以及如何控制其進一步分化的機制尚不完善；（2）干細胞移植尚無標準的方法及植入后相應(yīng)的評價體系仍缺乏；（3）尚無有效的方法針對植入宿主后發(fā)生的免疫反應(yīng)進行干預(yù)；（4）如何選擇運載體并使目的基因按預(yù)期表達尚無定論。

2　胚胎干細胞

胚胎干細胞（ESCs）是指來源于著床前囊胚期的內(nèi)細胞團（InnerCellMass，ICM）或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖細胞（PrimordialGermCell，PGC）中的一種多潛能細胞，在體外具有無限增殖和自我更新兩大特征。有研究表明，在一定的誘導(dǎo)環(huán)境下，ESCs可定向分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元［4-5］。Noisa等［6］成功將hESCs轉(zhuǎn)化得到人胚胎干細胞-神經(jīng)前體細胞（hES-NPS），將所得hES-NPS置于含1%FCS的N2、B27培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后發(fā)現(xiàn)β-tubulinⅢ和GFAP均呈陽性。若在N2培養(yǎng)基中改加弗斯可林（Forskolin）、血小板源性生長因子（PDGF）、三碘甲狀腺氨酸（T3）及維生素C，則少突膠質(zhì)細胞標志物Olig4呈陽性。此外，研究者將實驗組hES-NPS置于含SHH、FGF8培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并加入20ng/mLBDNF、20ng/mLGDNF、160μmol/L維生素C及0.5μg/mL層粘蛋白，免疫熒光下可見MAP2/TH陽性成熟神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)，實驗組與對照組（未加任何生長因子）MAP2/TH雙陽性細胞分別占（10.6±1.2）%及（3.8±1.2）%，同時還證實所得多巴胺神經(jīng)元表達NURR1，PITX3及EN1，推測其為中腦DA神經(jīng)元，為hESCs用于臨床提供了理論依據(jù)。Lee等［7］抑制了hESCs表面的一種糖蛋白PrPC（Prion Protein），然后將其置于DMEM中培養(yǎng)40d后發(fā)現(xiàn)，所得細胞TH、Olig1、GFAP的表達較對照組明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果說明抑制PrPC表達時，hESCs向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的分化會明顯減少。此外，實驗還觀察了hESCs的分化與具體抑制PrPC時間點的關(guān)系，通過觀察Syn、Olig1、GFAP的表達發(fā)現(xiàn)，hESCs的分化程度與PrPC被抑制的具體時間點無關(guān)，而與抑制持續(xù)的時間長短有關(guān)，當PrPC被全程抑制時，其Syn、Olig1、GFAP表達均呈陰性。由此說明，hESCs不僅可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞，而且在分化過程中PrPC的表達起著重要的作用。此外，Stacpoole等［8］對不同氧濃度環(huán)境下hESCs向神經(jīng)細胞分化的效率作了研究。實驗發(fā)現(xiàn)，hESCs誘導(dǎo)形成Hb9陽性運動神經(jīng)元時，3%氧氣環(huán)境下所得細胞的Olig2表達是20%氧氣環(huán)境下的2倍。同樣，當誘導(dǎo)其形成中腦多巴胺能神經(jīng)元時，其表達情況為3%氧環(huán)境下所得細胞EN1表達是20%氧環(huán)境下的5倍。說明hESCs在誘導(dǎo)分化時，3%氧氣環(huán)境下比20%氧氣環(huán)境下分化為神經(jīng)細胞的效率更高。這一結(jié)論對ESCs用于臨床有極大的使用價值。但目前將ESCs應(yīng)用于臨床替代治療仍然存在著一些問題，如ESC的致癌性及是否形成畸胎瘤等。此外，臨床應(yīng)用ESCs替代治療時，一定會涉及到細胞克隆技術(shù)及利用到人類早期胚胎等倫理學(xué)問題。諸多問題的限制，使ESC目前僅用于科研，難以臨床推廣。

3　骨髓間充質(zhì)干細胞

間 充 質(zhì) 干 細 胞（MensenchmalStemCells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，MSCs來源于中胚層間充質(zhì)，主要存在于結(jié)締組織及間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最高。目前，BMSCs跨胚層分化的具體機制仍然不太清楚，但有研究表明，BMSCs可以向神經(jīng)細胞分化［9-10］。Hermann等［11］發(fā)現(xiàn)人BMSCs不僅可以分化為神經(jīng)前體細胞，并且能夠高水平表達原神經(jīng)基因NeuroD1、Neurog2、MSl1、otx1及Nestin，并且前體細胞可繼續(xù)分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。Qiu等［12］將TrkC、NT-3基因分別導(dǎo)入大鼠BMSCs體內(nèi)，將轉(zhuǎn)基因BMSCs置于含5%FBS的DMEM中培養(yǎng)14d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NT-3-MSCs和TrkC-MSCs共培養(yǎng)組Tju-1為（88.25±4.31）%明顯高于其他組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此外，還觀察到突觸結(jié)構(gòu)，推測轉(zhuǎn)基因BMSCs已向神經(jīng)元分化。Bonaventura等［13］將人BMSCs置于DMEM中進行懸浮培養(yǎng)，并添加0.5mM異丁甲基黃嘌呤（IBMX）、1mM雙丁酰環(huán)磷腺苷（dbcAMP）、20ng/mL人表皮生長因子（hEGF）、40ng/mL堿性成纖維生長因子（bFGF）、10ng/mL神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）以及10ng/mL腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），10d后免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)GFAP和Nestin呈陽性，推測有神經(jīng)細胞形成。Nandy等［14］在誘導(dǎo)hBMSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化時發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入10ng/mLFGF2所得多巴胺濃度為（69.1±3.9）pg/mL明顯高于加入0.1μmol/L的ATRA所得多巴胺濃度時。此外，兩種培養(yǎng)基中GFAP陽性率分別為5.5% 和8.3%，提示培養(yǎng)基中有星形膠質(zhì)細胞形成。說明BMSCs在分化為神經(jīng)細胞的過程中，加入的生長因子不同，其進一步向神經(jīng)細胞分化的能力也有差異。雖然以上實驗均證明BMSCs可以向神經(jīng)細胞分化，但BMSCs在誘導(dǎo)分化過程中仍有不足之處，比如其特異性標記物目前尚缺乏、沒有標準化的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法等，此外，其分化效率也不太理想，以及分化所得的神經(jīng)樣細胞，是否具有神經(jīng)電生理功能等尚處于未知，這些問題仍有待解決。

4　臍帶血間充質(zhì)干細胞

臍帶血間充質(zhì)干細胞（UMSCs）是指來源于圍生期組織的一類不同于造血干細胞的、處于未分化狀態(tài)的多潛能干細胞，在不同的誘導(dǎo)環(huán)境下，UMSCs可以分化為任何組織細胞。盡管UMSCs在形態(tài)學(xué)上及分化性能上與BMSCs有較多的相似之處，但是由于BMSCs的分化能力受到供者年齡的影響，所以相比之下UMSCs比BMSCs更優(yōu)越。有研究表明，UMSCs在一定環(huán)境下可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞［15］。Bonaventura等［13］將hUMSC進行懸浮培養(yǎng)，并向培養(yǎng)基中加入1mol/LdbcAMP、0.5mol/L IBMX、20ng/mLhEGF、40ng/mLbFGF、10ng/mL NGF及10ng/mLBDNF，培養(yǎng)第6天時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中呈現(xiàn)出兩類細胞群：一類為膠質(zhì)細胞，包括星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞；另一類在免疫熒光染色證實為神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)，細胞數(shù)量較少，體積較小、呈圓形，推測為雙極神經(jīng)元樣細胞。第10天時，大約70%的細胞表現(xiàn)為GFAP、Nestin陽性。有研究將NTN基因和Lmx1a基因?qū)雋UMSC中，并將其先后置于神經(jīng)元前體細胞培養(yǎng)基和神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，第7天時發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元前體細胞特異性蛋白（Nestin）表達呈陽性，第21天時，成熟神經(jīng)元相關(guān)的特異性蛋白（NSE、MAP-2、β-tubulinⅢ）及多巴胺能神經(jīng)元特異性抗原均呈陽性，而且此時Nestin表達明顯降低［16］。提示hUMSC可以分化為神經(jīng)細胞，而且在分化的過程中，先是形成神經(jīng)前體細胞，然后再分化為神經(jīng)元。此外，實驗還將所得多巴胺神經(jīng)元移植入PD猴模型體內(nèi)，移植后猴PD癥狀明顯緩解，推測移植的多巴胺神經(jīng)元分泌了多巴胺。UMSCs在干細胞領(lǐng)域已經(jīng)占據(jù)越來越重要的地位，由于其來源相對簡便，免疫排斥反應(yīng)相對較弱，無論是在科研領(lǐng)域還是用于臨床，均有著廣闊的應(yīng)用前景。尤其是對于神經(jīng)退行性疾病，目前臨床仍無有效的治療方案，UMSCs可以作為臨床治療的種子細胞之一，但治療后的遠期效果尚需觀察，其安全性還有待進一步臨床考證。

5　脂肪源性干細胞

脂肪源性干細胞（ADSCs）是存在于脂肪組織中的、具有無限增殖、多向分化潛能的一類干細胞。ADSCs來源于中胚層，在特定的環(huán)境下，可以分化為骨組織、軟骨組織、肌肉組織和脂肪組織及包括神經(jīng)組織在內(nèi)的多種組織細胞。ADSCs體外培養(yǎng)相對簡單，增殖周期短、來源較為豐富，且無倫理學(xué)及法律方面的限制，是一種理想的備選細胞。自2001年Zuk等［17］發(fā)現(xiàn)并命名脂肪干細胞以來，ADSCs因為其眾多優(yōu)點而成為了繼骨髓源干細胞以后的又一大熱門研究。近年來，大量的實驗證明ADSCs可以向神經(jīng)細胞分化［18］。Wrage等［19］將小鼠ADSCs首先置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，3d后更換為10%FBS的NDM培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中加入120μmol/L吲哚美辛、3mg/L胰島素、300μmol/LIBMX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可檢測到Nestin、GFAP、NSE及Tuj1，提示得到了神經(jīng)樣細胞。隨后，應(yīng)誠誠等［20］在Wrage實驗的基礎(chǔ)上進行了改善，向培養(yǎng)基中加入EGF、bFGF 及BDNF培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，GFAP、β-tubulin表達陽性率分別為（74.0±3.3）%和（65.3±2.1）%。此外，Han等［21］將hADSCs和hBMSCs向神經(jīng)元分化的能力進行了比較。實驗將hADSCs和hBMSCs先置 于含1%FCS、10ng/mLbFGF和10ng/mLEGF的H-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后在含20ng/mL BFGF、20g/mLEGF、20ng/mL睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CiliaryNeurotrophicFactor，CNTF）和6mg/mLRA 的H-DMEM中培養(yǎng)30d后觀察發(fā)現(xiàn)：在0～7d，hADSCs與hBMSCs的MSCs形態(tài)特征開始逐漸消失，Nestin呈高表達狀態(tài)，兩者尼氏體含量分別是（2.1±2.5）%、（16.4±2.1）%；7d后，Nestin表達逐漸減少，hADSCs與hBMSCs中β-tubulinⅢ表達最高水平分別是（61.7±1.9）%和（63.9±0.8）%，說明hADSCs已經(jīng)向神經(jīng)細胞分化，而且與hBMSCs相比，其分化為成熟神經(jīng)元的速度相對較慢。雖然目前關(guān)于ADSCs的分化研究較多，但是對于ADSCs用于臨床替代治療仍然存在許多問題，比如脂肪干細胞分化的機制仍不明確、如何持續(xù)保留ADSCs分化特性及移植的細胞是否有致瘤性等問題。然而，雖然存在眾多問題，但其有著來源豐富、無倫理學(xué)及法律方面的限制等優(yōu)勢，這些研究必將被深入細化，隨著細胞分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，ADSCs在干細胞領(lǐng)域的移植治療必定有著廣闊的前景，無可替代。

6　外周血干細胞

外周血干細胞（PBSCs）是指釋放到血液中的造血干細胞，通常僅占干細胞0.06%。外周血中造血干細胞即外周血干細胞同樣具有干細胞的特點，具有分離獲取較為簡單、免疫源性相對較弱、無倫理學(xué)爭議等一系列優(yōu)點。目前已有研究的PBSCs主要為：CD34+造血干細胞（hematopoieticstemcells，HSCs）、外周血間充質(zhì)干細胞（PBMSCs）和單核細胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）。文獻［22］報道，PBSCs在適當?shù)奈h(huán)境下可以分化為神經(jīng)細胞。Wang等［23］將人外周血CD34+細胞通過病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)及培養(yǎng)后得到NSC，將所得NSC置于適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后分別得到了神經(jīng)元（β-tubulinⅢ+）、星形膠質(zhì)細胞（GFAP+）和少突膠質(zhì)細胞（O4+），并證實β-tubulinⅢ（+）神經(jīng)元為谷氨酸能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元及多巴胺能神經(jīng)元。Nichols等［24］從人外周血中分離出CD133+、ABCG2+、CXCR4+MSCs， 將 其 置 于DMEM-LG中培養(yǎng)，并向培養(yǎng)基中添加10%人血清、10-3M β-ME、5×10-7MRA，第7天時發(fā)現(xiàn)，實驗組較對照組MSCs體積明顯延長，并伴有較多的細胞突起，TH（45.2±9.7）%、Tuj1（35.23±7.9）% 和NEUN（28.2±11.1）%均明顯高于對照組，GFAP （4.88±2.4）%稍高于對照組的（3.49±0.7）%，說明hPBMSCs在適宜的誘導(dǎo)環(huán)境下可向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞方向分化。目前對于PBSCs的研究相對較少，仍有眾多問題亟待解決，比如如何提高PBSCs在體內(nèi)存活率，如何有效的控制其定向分化，分化所得的神經(jīng)樣細胞是否具備電生理功能及PBSCs的安全性如何等。盡管如此，隨著PBSCs研究的逐步深入，以及其操作相對簡單、易獲取且無倫理學(xué)限制等一系列優(yōu)點，必將為基礎(chǔ)及臨床研究所青睞，成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的另一個核心。

7　其他

除以上所述的干細胞外，近些年來造血干細胞（Hematopoieticstemcells）、表皮干細胞（Epidermal stemcells）、羊水源性干細胞（Humanamnioticfluid stemcells）和子宮內(nèi)膜干細胞（Humanendometrium stemcells）等向神經(jīng)細胞分化也有報道［13］。

綜上所述，盡管ESCs為干細胞中最為典型的代表，但由于其取材于胚胎早期階段，及倫理學(xué)和法律上的一些限制，致其科研及臨床應(yīng)用并不廣泛。BMSCs由于其體外可擴增，加之取材相對容易，目前被眾多學(xué)者所接受。但是對于BMSCs目前主要存在兩大問題：一是骨髓中可獲取的BMSCs數(shù)量太少，二是BMSCs的分化能力隨著供者的年齡增長會逐漸降低［25］。UMSCs是介于ESCs與BMSCs之間的一類干細胞，其來源相對豐富，獲取相對容易，且獲取過程中無侵襲性及副作用。此外，較其他干細胞而言，UMSCs分化潛能較高，是目前干細胞科研及臨床治療的最佳選擇。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.040

*基金項目：青海省科技創(chuàng)新能力促進計劃項目（2015-ZJ-943Q）

通信作者：李坤正

收稿日期：（2016-01-18）（本文編輯：李穎）