一株茶大灰象甲寄生真菌的分子鑒定及其毒力測定

王定鋒，李良德，李慧玲，張輝，王慶森，吳光遠

福建省農業科學院茶葉研究所，福建 福安 355015

茶大灰象甲(Sympiezomias citri)又名柑橘灰象甲，屬鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae），是一種重要的農業害蟲，主要以成蟲咀食茶樹、柑橘、桑樹和油茶等多種經濟作物的嫩芽枝葉為害為主，造成葉片殘缺不全，也可啃食幼果使果面殘留傷痕，甚至造成落果歉收，嚴重影響作物的產量和品質[1-2]。近年來，人們對食品安全問題的關注程度越來越高，促進了茶園、柑橘園等傳統種植業向無公害和有機農業發展。但這種農業管理模式卻使得茶大灰象甲的發生危害出現逐年加重的趨勢，常爆發成災[3-4]。長期以來，對茶大灰象甲主要還是以化學防治為主[4-9]?；瘜W防治雖然在一定程度上可以快速有效地防治該象甲，但化學農藥的長期大量使用所引起的農業“3R”問題，嚴重影響生態環境和人類健康。物理防治和農業防治雖然具有一定的效果，但耗時費力，不利于大面積的防治。因此，有必要尋找更加合適的防治手段來控制茶大灰象甲的發生和危害。

布氏白僵菌（Beauveria brongniartii），又名卵孢白僵菌，是一種重要的昆蟲病原真菌，可寄生7個目70多種昆蟲，尤其對鞘翅目害蟲具有獨特的寄生效果，被廣泛用于農林生態系統中金龜子和天牛等鞘翅目害蟲的防治[10-14]。據Faria統計，全球（除中國外）已登記的171個真菌殺蟲劑產品中，有7個產品是以布氏白僵菌為有效成份[15]。然而，當前還未見利用布氏白僵菌防治茶大灰象甲的報道。本研究對從茶大灰象甲自然羅病死亡的僵蟲中分離到的一株昆蟲病原真菌菌株的分類地位進行了分子鑒定，并測定其對茶大灰象甲成蟲的毒力，旨在為今后利用該菌防治茶大灰象甲奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蟲生真菌 Bbr4941菌株分離自自然羅病死亡的茶大灰象甲成蟲僵蟲（僵蟲采集自福建省福安市社口鎮茶園），并用薩氏培養基Sabouraud dextrose agar plus 1% yeast extract（SDAY）試管斜面保存于4℃冰箱中。

1.2 培養基

薩氏培養基（SDAY）：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%瓊脂，pH 7.0。高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min。

1.3 供試蟲源

于茶大灰象甲成蟲發生高峰期，從茶園中采集成蟲帶回實驗室，用新鮮茶梢飼養。2 d后挑選健康活躍、大小基本一致的成蟲用于室內毒力測定。

1.4 菌株分子生物學鑒定

以菌株Bbr4941基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS 1 （5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′） /ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′）[16]PCR擴增菌株rDNA-ITS序列；采用引物 B5.1F（5′-CGACCCGGC CAACTACTTTGA-3′） /B3.1R （ 5′-GTCTTC CAGTACCACTACGCC-3′）[17]擴增菌株 Bloc序列。rDNA-ITS序列和Bloc序列的PCR反應程序都為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，70℃ 30 s，30個循環；70℃延伸5 min。兩個片段的PCR反應體系都為：2×TaqMix 10 μL，模板 DNA 1 μL，引物（10 mmoL）各 1 μL，ddH2O 12 μL，總共 25 μL。PCR 產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化，送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。分別將rDNA-ITS序列和 Bloc序列測序結果通過 Blastn程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與在GenBank中的基因序列進行同源性分析。下載常見近緣種的 rDNA-ITS序列和 Bloc序列，分別用MEGA4.0軟件ClustalX方法進行多序列比對，并以鄰接法（neigbor-joining method）分別構建分子系統發育樹，用 Bootstrap對系統樹進行檢驗，1 000次重復[18]。

1.5 菌株對茶大灰象甲成蟲毒力測定

從SDAY平板上培養15 d的Bbr4941菌株中收集分生孢子，用0.05%吐溫-80溶液攪拌 均 勻 ， 配 成 每 毫 升 5.0×107、 1.0×107、5.0×106、1.0×106孢子4種孢懸液。參照王定鋒等[19-20]的方法進行浸蟲處理及培養，具體操作為：茶大灰象甲成蟲浸入孢懸液3~5 s后，立即取出，用無菌濾紙去除多余菌液后置于容量為1 L的塑料杯中，并用基部包有濕潤的無菌脫脂棉的新鮮茶枝飼養，每2 d更換1次茶枝。塑料杯口用紗網封住，置于人工氣候箱中（25℃、95%相對濕度和12L/12D的光周期）。每個濃度為 1個處理，每個處理15頭茶大灰象甲成蟲，重復3次，以0.05%吐溫-80溶液為對照。從處理后第2天開始，每天定時觀察各處理的死亡情況、做好記錄，同時將死蟲移出放于盛有濕濾紙的培養皿內保濕培養，觀察菌絲生長及產孢情況，并統計死亡率、校正死亡率和僵蟲率（蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子），并按照以下公式計算：

死亡率=死亡蟲口數/處理總蟲數×100%；

校正死亡率＝（處理組死亡率－對照組死亡率）/（1－對照組死亡率）×100%；

僵蟲率=死亡后形成僵蟲的蟲數/處理總蟲數×100%。

2 結果與分析

2.1 昆蟲病原真菌Bbr4941的分子鑒定

昆蟲病原真菌Bbr4941菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列PCR擴增、測序，分別獲得長度為590 bp和1 494 bp的基因片段，GenBank登錄號分別是MG837273和MG837274。通過Blast與GenBank中已有的核酸序列進行比對，結果表明，與Bbr4941菌株rDNA-ITS序列和Bloc序列相似性達100%的大部分序列分別都是布氏白僵菌的rDNA-ITS序列和Bloc序列。為進一步明確菌株Bbr4941與幾種常見白僵菌的親緣關系，分別選擇GenBank中已公布的或Rehner等報道[17]中確認的6種分類地位比較明確的白僵菌[多形白僵菌（Beauveria.amorpha）、（狹義）球孢白僵菌（B. bassiana）、布氏白僵菌（B. brongniartii）、蘇格蘭白僵菌（B.caledonica）、馬拉維白僵菌（B.malawiensis）和蠕孢白僵菌（B.vermiconia）]的rDNA-ITS序列和Bloc序列，分別用MEGA 4.0軟件鄰接法構建系統發育樹（圖1，圖2）。從圖1和圖2兩個系統發育樹都可以看出，菌株Bbr4941與其他布氏白僵菌聚在一個較小的進化分支上，具有很高的同源性，因此我們判定昆蟲病原真菌Bbr4941菌株為布氏白僵菌。

2.2 布氏白僵菌Bbr4941對茶大灰象甲成蟲的毒力

從圖3可以看出，隨著布氏白僵菌Bbr4941孢子濃度的增加和處理時間的推移，茶大灰象甲成蟲的死亡率不斷升高。每毫升5.0×107和1.0×107孢子處理時，第4天試蟲開始大量死亡；第7天累計死亡率分別為100%和97.22%。每毫升5.0×106、1.0×106孢子處理時，從第5天開始，試蟲死亡率才開始大量增加，第7天累計死亡率分別為75%和61.11%。從表1可以看出，布氏白僵菌Bbr4941對茶大灰象甲成蟲的殺蟲毒力存在明顯的時間-劑量效應。孢子濃度越高，茶大灰象甲成蟲的LT50值越小。當達到每毫升1.0×106~5.0×107孢子時，處理7 d，茶大灰象甲成蟲死亡率為61.11%~100%，LT50值為5.921~3.916 d。應用SPSS軟件的probit程序計算出布氏白僵菌Bbr4941對茶大灰象甲成蟲第7天的LC50值為每毫升8.33×105孢子，95%置信區間為每毫升2.43×105~1.49×106孢子。

3 討論

昆蟲病原真菌侵染寄主包含體表附著、體壁穿透和體內定殖3個階段，整個過程涉及寄主識別、機械破壞、營養競爭、代謝干擾、毒素分泌及寄主組織結構破壞等，這些因子共同作用最終導致寄主死亡[21]。這種獨特的殺蟲方式，使害蟲不能產生抗性，且具有易于生產、環境兼容性好和對靶標害蟲專一等優勢，在茶大灰象甲的田間大面積防治上具有極大的應用潛力。本研究獲得的布氏白僵菌 Bbr4941孢懸液（每毫升5.0×107孢子）處理茶大灰象甲成蟲7 d，其累計校正死亡率為100%，LT50為3.916 d；該結果與王定鋒等[22]通過室內毒力測定，從15株白僵菌菌株中篩選出的對茶大灰象甲成蟲高毒力的球孢白僵菌菌株Bb2-1的殺蟲活性相當，說明布氏白僵菌Bbr4941也具有很強的殺蟲活性和生防潛力。此外，本研究獲得的茶大灰象甲寄生菌 Bbr4941為布氏白僵菌，在分類上與球孢白僵菌屬于同屬不同種，這也進一步豐富了茶大灰象甲生防真菌的資源庫，將在今后茶大灰象甲的田間防治中發揮重要作用。

圖1 基于rDNA-ITS序列的Bbr4941菌株及白僵菌類群的系統發育樹Fig. 1 Phylogeny analysis of rDNA-ITS gene sequences of Bbr4941 and Beauveria

圖2 基于Bloc序列的Bbr4941菌株及白僵菌類群的系統發育樹Fig. 2 Phylogeny analysis of Bloc gene sequences of Bbr4941 and Beauveria

圖3 白僵菌Bbr4941不同孢子濃度對茶大灰象甲成蟲的毒力Fig. 3 The toxicity of Bbr4941 against the adults of S. citri

表1 不同孢子濃度下菌株Bbr4941對茶大灰象甲成蟲的毒力Table1 Virulence of the strain Bbr4941 against adults of S. citri under different spore concentrations

隨著分子生物學技術的飛速發展，GenBank數據庫中真菌的各種標記序列不斷增多，給真菌新菌株的分子鑒定奠定了堅實的基礎。Johny等[23]通過對 ITS，EF1-a和 Bloc片段的擴增和測序，從分子水平上對分離自鞘翅目害蟲（Agrilus planipennis）爆發的森林中分離到的78個白僵菌菌株進行鑒定，并明確了這些菌株的分類地位。Carrillo-Benítez等[24]利用ITS和EF1-a對分離自蠐螬幼蟲的17株白僵菌進行了分子鑒定，發現所有的白僵菌都屬于（Beauveria pseudobassiana）。為明確從瑞士境內獲得的花粉甲蟲白僵菌的分類歸屬，Meyling等[25]通過對菌株 ITS，EF1-a和 Bloc片段的擴增和測序，最終確定了這些白僵菌包括球孢白僵菌和布氏白僵菌。Medo等[26]利用ITS和Bloc序列對分離自斯洛伐克土壤的109個白僵菌進行鑒定，結果表明這些菌株包括B. bassiana，B. pseudobassiana和B.brongniartii3大類。本研究通過對分離自茶大灰象甲僵蟲的昆蟲病原真菌 Bbr4941菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列的擴增、測序和系統發育樹構建，明確了所獲得的Bbr4941菌株是布氏白僵菌，該結果也進一步證實了前人利用真菌常用標記序列可有效地對新分離到的菌株進行分子鑒定的結論[23-26]。

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