第二代高通量測序技術的原理及其在醫學中的應用進展

杜兵兵

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第二代高通量測序技術的原理及其在醫學中的應用進展

杜兵兵

【摘要】第二代高通量測序技術近年來取得了較快發展，與第一代測序技術相比具有速度快、準確率高、成本低等優點，主要包括454測序技術、Solexa測序技術以及SOLID測序技術。高通量測序技術在醫學領域的研究越來越廣泛，本文介紹了幾種高通量測序技術的作用原理以及它們在臨床方面的應用情況。

【關鍵詞】高通量測序技術；454測序技術；Solexa測序技術；SOLID測序技術；臨床應用

2005年Nature首次報道了454公司最新的基于微乳液PCR技術的高通量測序技術[1]，之后全球各個科研機構和生物公司相繼開展高通量測序技術的研究工作。在這些競爭中脫穎而出的有羅氏公司的454測序、Illumina公司的Solexa測序以及ABI公司的SOLID測序[2]，它們逐漸成為新一代高通量測序技術的代表者。這些測序技術已經越來越廣泛地應用于醫學領域，主要運用于腫瘤、病原生物學等的預防、檢測及治療，成為臨床研究領域的重要技術手段。

1　第二代高通量測序的原理

1.1454高通量測序

454高通量測序是一種依靠生物發光進行DNA序列分析的新技術。根據樣品種類和實驗目的，將DNA文庫固定在相應的捕獲磁珠上，形成油包水混合物，接著經過乳液PCR擴增形成單分子多拷貝的分子簇．隨后將乳液體系里釋放出來的磁珠放入VFP板的小孔進行后續的測序，對每個小孔中的DNA片段分子進行準確快速的堿基序列分析[3]。454測序成本較高，限制了該平臺的市場化普及。

1.2Solexa高通量測序

Solexa高通量測序采用的是邊合成邊測序，先根據實驗需要將目標DNA處理成小片段，接著將片段DNA回收并通過兩個接頭鏈接，這兩個接頭是通用的，之后將其處理成為單鏈狀態，這時就會與芯片表面的堿基進行互補雜交固定在芯片上，另一端隨機與相鄰的另一個引物結合形成“橋”，反復上述過程30次左右則每個分子被放大1 000倍以上，成為單克隆的DNA簇，然后通過帶熒光標記的 dNTP“可逆終止子”（3’端被一個疊氮基堵住）進行邊合成邊測序。用不同熒光標記不同堿基則可以激發產生不同顏色的熒光，統計每一輪反應結束后采集到的熒光信號，通過處理就可以知道原來模板DNA片段的序列[4]。該平臺成本低、性價比高，是主要的測序平臺。

1.3SOLID高通量測序

SOLID高通量測序技術以四色熒光標記寡核苷酸的連續連接合成為基礎，采用DNA連接酶實現邊合成邊測序。該技術可以很大程度上降低錯誤率。因為測序過程中應用雙堿基編碼，即每個堿基被重復閱讀2次，這樣就使得SOLID系統原始堿基數據的準確度大于99.94%。該方法測序時儀器會自動加入帶有熒光標記的四種核苷酸探針，加入的探針與引物發生相應的連接反應，之后通過激發末端的熒光標記，識別堿基類型完成測序。SOLID測序的特點是是高通量、高準確度[5]。

2　第二代高通量測序在臨床上的應用

2.1腫瘤研究方面

腫瘤是生物有機體受到致癌因素作用后，局部組織的某些細胞失去對其生長的正常調控，導致異常增生而形成的病變。有機構預測至2020年將有2 000萬新發癌癥病例，其中絕大部分將發生在發展中國家。高通量測序技術在腫瘤學的前期研究、臨床診斷和治療恢復方面都具有重要作用，它為腫瘤研究提供了一種與基因芯片技術互補的新工具，可以進行腫瘤基因組序列的再測序，從而達到對腫瘤基因組拷貝數、不同類別突破、基因相關性以及多態性的分析[6]。

2.2病原生物學檢測

病原微生物可以侵犯人體，引起感染甚至傳染病。高通量測序技術的出現使得病原體在檢測前不再需要進行培養分群即可直接測序鑒別。2011年5月德國由于大腸桿菌感染引起3 000多人感染。當地醫療機構采用Illumina HiSeq平臺測序系統對病原體進行了緊急基因組測序分析，在不到10天時間內即完成了測序工作，對病原體進行了詳細的毒力、耐藥和遺傳進化分析，最后發現該病原體是Shiga毒素E.coliO104:H4株[7]。

參考文獻

[1] Margulies M，Egholm M，Altman WE，et a1． Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J]． Nature，2005，437（7057）：376-380．

[2]Shendure J，Ji H． Next-generation DNA sequencing[J]． Nat Biotechnol，2008，26（10）：1135-1145．

[3]Rothberg JM，Leamon JH． The development and impact of 454 sequencing [J]． Nat Biotechnol，2008，26（10）：1117-1124．

[4]許波，張偉強，馮曉曦，等． 轉錄組測序技術在玉米中的應用研究進展[J]． 玉米科學，2014，22（1）：67-72．

[5]楊燁，劉娟． 第二代測序序列比對方法綜述[J]． 武漢大學學報，2012，58（5）：463-470．

[6]Piffer GP． Besraatinia A Mutational spectra of human cancer[J]． Hum Genet J，2009，125（5）：493-506．

[7]Rohde H，Qin J，Cui，et a1． Open-source genomic analysis of Shiga-toxin-producing E．coli O104：H4 [J]． N Engl J Med，2011，365（8）：718-724．

·論著·

The Working Principle of Second-generation High-throughput Sequencing Technology and its Application in Clinical Medicine

DU Bingbing, Luohe Medical College, Luohe 462002, China

[Abstract]The second-generation high-throughput sequencing technology has achieved rapid development in recent years. Compared with the first generation, the second-generation sequencing technology is with the advantages of faster, higher precision, and lower cost. The main technologies include 454 sequencing technology, Solexa sequencing technology and SOLID sequencing technology. High-throughput sequencing technology is more widely used in medical areas. This is a brief overview for the working principle of the second-generation highthroughput sequencing and its application in clinical medicine

[Key words]High-throughput sequencing, 454 sequencing technology, Solexa sequencing technology, SOLID sequencing technology, Clinical application

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．03．153

【文章編號】1674-9308（2016）03-0215-02

【中圖分類號】G642

【文獻標識碼】A

作者單位：462002 漯河醫學高等專科學校