漢黃芩素對人肝癌SMMC-7721的抑制作用及其作用機制研究

王曉東

漢黃芩素對人肝癌SMMC-7721的抑制作用及其作用機制研究

王曉東

目的研究漢黃芩素對SMMC-7721細胞的抑制及其作用機制。方法MTT法檢測細胞的增殖抑制率，Western-blot檢測細胞凋亡通路中關鍵蛋白Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的表達水平。結果漢黃芩素能抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖，作用癌細胞后，Procaspase-9蛋白的表達水平明顯降低，Pro-caspase-8的表達水平無明顯變化。結論漢黃芩素能夠抑制SMMC-7721細胞增殖，漢黃芩素通過線粒體信號通路促進人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡，漢黃芩素作為抗肝癌藥物具有廣闊的應用前景。

漢黃芩素；肝腫瘤；細胞凋亡

漢黃芩素全稱是5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮[1]，是傳統中草藥黃芩中發現41種黃酮類化合物的有效成分之一[2]。自從漢黃芩素被發現有抗腫瘤活性以來[3]，研究人員從卵巢癌[4]﹑乳腺癌[5]﹑鼻咽癌[6]等方面對漢黃芩素的抗癌作用及作用機制進行了深入的研究[7]，發現漢黃芩素對腫瘤細胞的殺傷作用有其獨特的機制[8]。本研究將對此做進一步研究。

1 試劑及儀器

人肝癌SMMC-7721細胞株來源于本醫院實驗中心自我凍存；漢黃芩素購自上海源葉生物科技有限公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購﹑蛋白定量試劑盒﹑蛋白提取液等購自碧云天公司。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測不同濃度漢黃芩素作用細胞后對細胞增殖的影響

取處于生長對數期且生長狀態良好的SMMC-7721細胞接種于96孔板中，接種密度5×104個/100 μL/孔。分別加入50﹑100﹑150﹑200﹑250 μmol/L的漢黃芩素作為實驗組，并以不加漢黃芩素的作為對照組。分別作用24 h和48 h后在培養體系中加入MTT試劑染色，測定各孔A570。

2.2 Western-blot 檢測細胞凋亡通路中關鍵蛋白Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的表達水平

步驟如下：（1）利用漢黃芩素處理SMMC-7721細胞48 h；（2）超聲細胞破碎機將細胞充分破碎；（3）將破碎后細胞混合物離心機10 000 g條件下離心15 min；（4）提取總蛋白；（5）SDS-PAGE蛋白質電泳進行蛋白分離；（6）電泳結束后將分離的蛋白轉移PVDF印跡膜上；（7）5%脫脂奶粉中封閉2 h；（8）Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的一抗與PVDF膜過夜孵育；（9）用PBST清洗混合液；（10）二抗抗體室溫且避光條件下共孵育；（11）曝光顯影；顯影后圖片用Bio-Rad Image分析系統查看。:

3 實驗結果

3.1 MTT實驗結果

不同濃度漢黃芩素作用肝癌SMMC-7721分別作用24 h和48 h后，實驗結果顯示，不同濃度的漢黃芩素均可以對SMMC-7721細胞的增殖產生抑制作用；作用時間越長，對細胞增殖的抑制作用越明顯；作用48 h后，抑制細胞生長達50% 時的漢黃芩素濃度為210 μM。

3.2 Western Bolt檢測Pro-caspase-9和Pro-caspase-8蛋白實驗結果

利用漢黃芩素處理肝癌細胞48 h，提取細胞總蛋白并利用Western Bolt檢測試劑盒檢測細胞凋亡兩種信號通路中的關鍵蛋白Pro-caspase-9及Pro-caspase-8的表達水平。Western Bolt檢測結果顯示：漢黃芩素作用肝癌細胞前后，作為參照的β-actin的灰度值分別為0.785﹑0.794；Pro-caspase-8的灰度值分別為0.598﹑0.612；Pro-caspse-9的灰度值分別為0.608﹑0.397。結果表明，Pro-caspase-8的表達水平并無明顯變化（P=0.328＞0.05）；Pro-caspse-9的表達水平明顯降低（P＜0.001）。

4 討論

本研究在確認了漢黃芩素對肝癌SMMC-7721細胞的增殖抑制及肝癌細胞致死作用之后，對漢黃芩素促肝癌細胞凋亡的信號通路進行了探討，以進一步揭示漢黃芩素對肝癌細胞的分子作用機制。

隨著分子生物學研究的不斷深入，極為復雜的細胞凋亡的信號通路和分子機制的研究取得了重大進展。細胞凋亡主要有兩條信號通路：線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路。線粒體通路又稱內源性凋亡途徑，在有藥物誘導等外源性刺激情況下，分布于線粒體膜間隙的細胞色素C（Cytc）等促凋亡活性蛋白釋放至包漿內，活化半胱氨酸天冬酶-9前體（Pro-caspase-9），從而激活半胱氨酸天冬酶-9（Caspase-9），進一步切割底物使細胞凋亡；死亡受體通路也成外源性凋亡途徑，該途徑為胞外信號所誘導的細胞凋亡途徑，死亡因子受體（Fas）在胞外死亡去形成死亡誘導信號復合物（DISC）后引起胞質內Pro-caspase-8（半胱氨酸天冬酶-8前體）活化，從而激活Caspase-8（半胱氨酸天冬酶-8），進一步啟動下游caspase相關蛋白酶級聯反應，最終導致細胞凋亡。本研究結果表明漢黃芩素對人肝癌SMMC-7721細胞的增殖具有抑制作用，且漢黃芩素誘導細胞凋亡主要是通過線粒體信號通路實現。

綜述所述，Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的活化是兩條細胞凋亡途徑的主要區別。本研究通過Western Blot法檢測了漢黃芩素作用前后人肝癌SMMC-7721細胞中Pro-caspase-9和Pro-caspase-8表達水平的變化，結果發現，漢黃芩素作用后Pro-caspase-9的表達水平明顯降低而Pro-caspase-8的表達水平無明顯變化。本研究表明，漢黃芩素對肝癌細胞的作用機制是通過線粒體信號通路實現的。漢黃芩素作為抗腫瘤藥物尤其是在抗肝癌腫瘤方面具有廣闊的應用前景。

[1]趙田禾，張瑩瑩，吳洋洋，等. 漢黃芩素及其衍生物的抗腫瘤作用及其分子機制的研究進展[J]. 中國新藥雜志，2016，26（7）：760-766.

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[3]嚴靜怡，陳寶安. 漢黃芩素的提取及抗腫瘤的作用機制[J]. 時珍國醫國藥，2012，23（9）：2210-2212.

[4]張娜，周琦，陸松梅，等. 漢黃芩素逆轉卵巢癌SKOV3細胞對順鉑的耐藥性[J]. 腫瘤，2016，36（2）：166-172.

[5]黃愷飛，莊媛，黃亦琦，等. 漢黃芩素抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲的實驗研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（8）：1485-1489.

[6]凌丹，許磊，楊光東，等. 漢黃芩素體外抗人喉癌Hep2細胞增殖、凋亡和侵襲的作用及機制研究[J]. 河北醫藥，2016，38（7）：987-990.

[7]彭苗新，張海偉，陳寶安.漢黃芩素抗腫瘤作用的分子機制中的主要信號通路（英文）[J]. 中國天然藥物，2012，9（6）：401-407.

[8]肖煒明，卜平，龔衛娟. 漢黃芩素抗腫瘤和免疫調節作用的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2014，39（16）：3004-3009.

The Anti-tumor Effect of of Wogonin for SMMC-7721 Hepatocellular Carcinom Cells and its Mechanisms

WANG Xiaodong Department of Pharmacy, The Sixth Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou Guangdong 510000, China

ObjectiveTo observe the anti-tumor effects of Wogonin and investigate the underlined mechanisms preliminarily.MethodsSMMC-7721 cells were cultured with different concentrations of Wogonin and for 24 h or 48 h, cell viabilities were measured by the MTT assay, the expression levels of Pro-caspase-9 and Pro-caspase-8 were detected by Western-blot experiment.ResultsWogonin could inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells, after cultured with the Wogonin, the expression levels of Pro-caspase-9 decreased obviously, and the expression levels of Pro-caspase-8 had no obvious decrease.ConclusionThe wogonin has the function of inhibition of the SMMC-7721 cells, the study shows that the wogonin induces tumor cells apoptosis by the mitochondrial pathway, there are broad application prospects for Wogonin as an anti-tumor drug.

Wogonin, Liver neoplasms, Apopatosis

R735.7

A

1674-9308（2016）34-0180-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.34.100

中山大學附屬第六醫院藥學部，廣東 廣州 510000