2型糖尿病伴或不伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌的差異

程曉亮 朱寅榮 于南南 戴麗芬 曹立君

?

2型糖尿病伴或不伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌的差異

程曉亮 朱寅榮 于南南 戴麗芬 曹立君

【摘要】目的 研究2型糖尿病伴或不伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌是否存在差異。方法 選取30例2型糖尿病不伴胃腸神經功能紊亂（對照組）患者及30例2型糖尿病伴胃腸神經功能紊亂（實驗組）患者，收集糞便樣品，提取樣品中細菌DNA，根據雙歧桿菌總菌的16SrRNA序列設計特異性引物，并應用實時熒光定量PCR技術對60例糞便樣品中的雙歧桿菌總菌進行定量檢測。結果 實驗組腸道雙歧桿菌總菌較對照組減少（P＜0.05）。結論 2型糖尿病伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌總菌數量減少，可能與2型糖尿病患者胃腸神經功能紊亂的發生發展存在相關性。

【關鍵詞】2型糖尿病；胃腸功能紊亂；雙歧桿菌

2型糖尿病是由環境及遺傳等多種復合病因引起的綜合征，其發病機制尚未完全闡明［1-3］。目前對于2型糖尿病伴或不伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌差異尚無研究，本研究以實時熒光PCR定量技術測定2型糖尿病伴或不伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌總菌數量的變化，為研究糖尿病胃腸神經功能紊亂與腸道菌群的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象及標本采集

選取2014年3～9月在昆明醫科大學第二附屬醫院內分泌科住院，年齡50～70歲的患者作為研究對象，納入2型糖尿病不伴胃腸神經功能紊亂的患者30例為對照組，男20例，女10例，平均年齡（61.23±9.04）歲；30例2型糖尿病伴胃腸神經功能紊亂患者為實驗組，男20例，女10例，平均年齡（62.50±8.15）歲。兩組研究對象一般資料差異無統計學意義。采集60名患者的糞便樣品。

1.2 主要實驗試劑和儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANampBacterria DNA Kit）、PBS液（0.01 mol/L，pH 7.4）、質粒提取試劑盒（TIANGEN 100次質粒小提）、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，SYBR Green熒光染料、dNTP、TaqDNA聚合酶、DNA分子標準Marker、T載體試劑盒（TAKARA pMD19T simple），均購自寶生物工程（大連）有限公司，實驗所用引物、GlodViewⅠ染料購自生工生物工程（上海）有限公司，PCR儀（ABI，USA）、凝膠成像系統、熒光定量PCR儀BIORAD CFX96。

1.3 實驗方法

取濕重糞便樣品1 g加10 ml滅菌PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），充分振蕩混勻10 min，隨之低速離心（3 000 r/min）5 min，留取上清，上述過程重復3次。將所收集到的上清液高速離心（12 000 r/min）10 min，然后棄上清，收集沉淀，并用10 ml PBS懸浮，12 000 r/min離心5 min，沉淀重復洗滌3次，所得菌體用1 ml無菌水懸浮混勻，裝至1.5 ml EP管中，并以12 000 r/min 離心5 min。得到的菌體沉淀保存于-20℃。使用細菌基因組DNA提取試劑盒，并嚴格按照說明書步驟進行提取。選用的引所物序列如下：雙歧桿菌總菌：上游：AGAACCTTACCTGGGCTTGA；下游：CCTTCCTCCGAGTTGACCC，片段大小208 bp。以2型糖尿病不伴胃腸神經功能紊亂患者糞便樣本提取的細菌基因組DNA為模板進行常規PCR反應，制備質粒標準品，通過實時熒光定量得出雙歧桿菌總菌的拷貝數。

1.4 統計學分析

所得數據應用SPSS17.0軟件處理，雙歧桿菌總菌計量資料結果均經正態性檢驗，以（均數±標準差）表示，對照組與實驗組組間差異用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對照組雙歧桿菌總菌數量為（9.11±0.62）log10 copies/g，實驗組雙歧桿菌總菌數量為（8.35±0.69）log10 copies/g。與對照組相比，實驗組腸道雙歧桿菌數量減少，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

人體腸道中生存著大約1 800個屬，至少40 000種細菌，其數量多達1 014個。隨著科技的發展，被人類所識別的菌種已超過1 250個［4］。近年來，越來越多的學者認為腸道菌群是控制體質和能量代謝的一個重要因素，并且與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關［5］。雙歧桿菌作為人體腸道菌群中的優勢菌屬，對維持腸道菌群與宿主之間相互作用的穩定發揮著重要的作用，其數量的改變，可影響整個腸道菌群及腸道微生態平衡，從而影響宿主的健康狀態。有研究表明，2型糖尿病患者存在腸道菌群的失調，表現為腸桿菌科細菌含量增加，類桿菌含量減少等［6］。

在本實驗中，通過PCR進行雙歧桿菌總菌絕對定量，結果顯示，2型糖尿病伴胃腸神經功能紊亂患者腸道雙歧桿菌總數較2型糖尿病不伴胃腸神經功能紊亂患者明顯減少。由此可以推測糖尿病胃腸神經與雙歧桿菌數量改變之間可能存在相關性，這也許為腸道菌群改變與糖尿病性胃腸神經功能紊亂間相互作用提供了一些依據。可能的機制：（1）腸道菌群發生紊亂后引起腸道屏障功能破壞、滲透壓改變、腸菌代謝物改變、信號傳導遞質改變，導致腸道神經元及微血管對高糖刺激敏感性改變，影響了正常的消化道功能。（2）腦-腸-微生物作用［7］。腸道菌群不僅能夠直接影響植物傳入神經影響消化道功能，也能通過其產物作用于腸上皮細胞相應受體，產生信號分子，或是通過對一些機體所不能利用的酶，對免疫因子的賦活作用，來改變腸道運動及滲透壓，調節免疫功能，影響腸激素如GLP1、GLP2、PYY的分泌［8］，在中樞神經系統與腸道的交互作用中扮演著信號傳遞者的角色。

本研究對2型糖尿病伴胃腸神經病變患者與2型糖尿病不伴胃腸神經病變患者之間腸道雙歧桿菌的差異進行了初步的探討，為進一步研究腸道菌群與2型糖尿病胃腸神經病變之間的關系提供重要線索，并為其治療靶點提供一些有價值的資料。

參考文獻

［1］ Larsen N，Vogensen FK，van den Berg FW，et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults［J］. PloS one，2010，5（2）：e9085.

［2］ Zhang X，Shen D，Fang Z，et al. Human gut microbiota changes reveal the progression of glucose intolerance［J］. PLoS One，2013，8 （8）： e71108.

［3］ Lê KA，Li Y，Xu X，et al. Alterations in fecal Lactobacillus and Bifidobacterium species in type 2 diabetic patients in Southern China population［J］. Front Physio，2012，3：496.

［4］ Mariat D，Firmesse O，Levenez F，et al. TheFirmicutes/ Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age［J］. BMC Microbiol，2009，9（1）：123.

［5］ Cani PD，Delzenne NM. Gut microflora as a target for energy andmetabolic homeostasis［J］. Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2007，10（6）：729-734.

［6］ 肖黨生，王招娣，楊云梅，等. 糖尿病患者腸道菌群研究［J］. 中國微生態學雜志，2006，18（4）：275-276.

［7］ Mayer EA. The neurobiology of stress and gastrointestinal disease［J］. Gut，2000，47（6）： 861-869.

［8］ Rhee SH，Pothoulakis C，Mayer EA. Principles and clinical implications of the brain-gut-enteric microbiota axis［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2009，6（5）：306-314.

【中圖分類號】R587

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）15-0068-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.043

基金項目：云南省教育廳項目（2013Y294）

作者單位：昆明醫科大學第二附屬醫院內分泌科，云南 昆明 650101

Differences Between the Intestinal Bifidobacteria for the Type 2 Diabetes Patients With or Without Gastrointestinal Dysfunction

CHENG Xiaoliang ZHU Yinrong YU Nannan DAI Lifen CAO Lijun
Department of Endocrinology， The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming Yunnan 650101， China

［Abstract］Objective To distinguish the differences between the intestinal bifidobacteria for the type 2 diabetes patients with or without gastrointestinal dysfunction. Methods Select 30 cases of type 2 diabetes patients without gastrointestinal dysfunction （control group） and 30 cases with gastrointestinal dysfunction （experimental group）. Extract the bacterial DNA of the fecal samples， and design the specific primer of bifidobacteria according to the bacterial 16SrRNA sequence. Apply the real-time PCR technology to detect quantitatively the total bacteria of bifidobacteria， which is taken from two different group of samples. Results The total number of bifidobacteria for the experimental group is less than the control group significantly （P＜0.05）. Conclusion The total number of bifidobacteria for the type 2 diabetes patients with gastrointestinal dysfunction decreased，and reducing the number of intestinal bifidobacterium may interact with thedevelopment of gastrointestinal disorders in patients with type 2 diabetes.

［Key words］Type 2 diabetes， Gastrointestinal disorders， Bifidobacteria