茶樹葉綠素測定方法的比較研究

向 芬，李 維，劉紅艷，周凌云，丁 玎，曾 振

（湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

茶樹葉綠素測定方法的比較研究

向 芬，李 維，劉紅艷，周凌云，丁 玎，曾 振

（湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

為了探討適合茶樹大量樣本葉綠素含量測定的方法，本試驗綜合植物葉綠素的測定方法，以丙酮研磨法為對照，使用浸提法設置6種提取液（95%乙醇、80%丙酮、丙酮∶乙醇=2∶1、丙酮∶乙醇=1∶2、丙酮∶乙醇=1∶1、丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1）進行浸提效果試驗，并對提取液進行光穩定試驗。結果表明：以丙酮∶乙醇=1∶2的提取效果好，光穩定性也較好；丙酮∶乙醇=2∶1、丙酮∶乙醇=1∶1的次之；單一溶劑以95%乙醇浸提效果較好。表明測定茶樹大量樣本的葉綠素宜選用丙酮∶乙醇為1∶2的混合液法，該方法操作簡便、穩定性好；考慮環保因素，則以95%乙醇溶劑浸提法較好。

茶樹；葉綠素；提取；測定方法

葉綠素是綠色植物進行光合作用的基礎物質，是植物葉片的主要光合色素，其含量的多少與光合能效的高低有著重要關系，是研究茶樹氮素營養等生理變化的重要指標[1,2]。目前，測定葉綠素含量主要有分光光度計法和SPAD葉綠素測定儀法。由于SPAD葉綠素儀測定的是相對含量，在日常試驗中以分光光度計法測定葉綠素的絕對含量應用最廣泛。

植物葉綠素的測定因所用的溶劑不同又有多種測定方法，國際上廣泛采用Arnon法[3]。但該方法由于要先加入石英砂研磨，研磨后又需過濾、除渣，工作量大，步驟多，不適宜田間大量樣品的提取和測定[4]。張憲政提出了丙酮乙醇混合液法浸提葉綠素，驗證了利用混合液進行葉綠素浸提的可行性[5]。何麗斯等[6]研究發現以丙酮∶無水乙醇∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1的混合液浸提杜鵑葉綠素效果較好。徐芬芬[7]等研究認為，丙酮與乙醇體積比1∶1的混合液浸提小白菜葉綠素效果最好 ；而麻明友[8]、任紅等[9]研究結果顯示，丙酮與乙醇體積比2∶1的混合液分別浸提獼猴桃、菜心葉綠素效果較好。

前人對植物葉綠素的測定方法因植物種類不同結果各異。而茶樹葉綠素含量的測定，徐華等[10]通過研究證明丙酮∶無水乙醇∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1混合液法提取葉綠素效果又快又好；隨后肖潤林等[11]、唐茜等[12]引用徐華等的方法測定茶樹葉綠素含量，唐曉波等[13]采用丙酮分光光度法測定不同季節茶葉中葉綠素含量，趙先明等對幾種混合液的浸提方法進行了比較，發現丙酮∶乙醇∶水= 3∶6∶1的效果較好，較丙酮研磨法及其它幾種丙酮、乙醇混合液的提取方法有極顯著的差異。本試驗在前人研究的基礎上，以丙酮研磨法作為對照，綜合植物上常使用的葉綠素測定方法，對研磨法和浸提法進行了比較，為田間大批量樣本葉綠素含量的測定提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樹為湖南本地品種碧香早，丙酮、95%乙醇等試劑均為分析純，試驗用水為去離子水。

1.2 試驗設計

采取直接浸提法，設6種處理，以丙酮研磨法為對照（表1）。

表1 不同測定方法設置Table 1 Different determination methods

1.2 測定方法

1.2.1 浸提效果試驗

所選葉片為茶樹倒三葉，低溫保存。準確稱取0.5 g試材于試管中，剪取葉片成2 mm×1 cm碎條，在室溫下立即用丙酮研磨法和直接浸提法提取葉綠素，每個處理3次重復。浸提在黑暗中進行，每管加入浸提液10 mL，并定時搖動，待葉片變白，約14 h后定容至25 mL，測定吸光度。研磨法參照任紅等的方法[9]。室溫下以相應試劑為參比，分別在645 nm和663 nm處測定吸光度，由Arnon公式計算葉綠素a與葉綠素b的含量。

1.2.2 光穩定性試驗

樣品測定后室溫曝光放置5 h，測定提取液中葉綠素的含量。

1.3 數據處理

式中：A663nm、A645nm分別為663 nm、645 nm波長下的吸光度，V為提取液的體積，W為葉片的鮮重。

利用Excel 2003軟件對所得數據進行處理，利用DPS14.5軟件進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同浸提液對茶樹葉綠素提取效果的影響

由表2可見，不同浸提液的提取效果存在差異，與對照比，處理C、D、E提取方法的效果較好，其中處理D較對照好，但效果與對照差異不顯著；其次為A提取方法，B、F提取效果較對照差，差異極顯著。

2.2 不同浸提液對茶葉葉綠素光穩定性的影響

由表3可知，采用不同提取溶劑提取的茶葉葉綠素，在室溫下放置5 h后，葉綠素含量以D提取方法的效果較對照好，C、E提取方法次之，B、F提取效果較對照差；同時發現，各種提取方法均以葉綠素a降解較葉綠素b快，C、D、E提取方法的葉綠素a降解較對照慢。

表2 不同浸提液方法葉綠素含量比較Table 2 Comparison of chlorophyll content with different extraction methods

表3 不同浸提液提取葉綠素含量變化Table 3 Changes of chlorophyll content with different extracts after exposure to 5h

3 討論

選擇穩定、高效的葉綠素提取方法有利于得到準確、可靠的數據。通常進行葉綠素測定需要進行不同處理以及實驗重復的取樣，樣本量大，采用研磨法較費時間，且茶葉中的多酚物質在細胞破碎、葉綠體破壞后形成許多的降解產物，易造成提取液不穩定，長時間放置影響更大，因此大量樣本的葉綠素測定采用浸提法較方便，有研究者還發現影響葉綠素提取效率的關鍵是葉綠素a 的穩定性[4]。前人對植物葉綠素測定因植物種類不同結果各異，但均發現丙酮、乙醇混合溶劑浸提效果較好。本試驗亦發現丙酮、乙醇混合溶劑提取茶葉葉綠素效果以及光穩定性均較好，其中以丙酮 ∶ 乙醇為1∶2的效果較研磨法好，丙酮 ∶ 乙醇為2∶1、丙酮∶乙醇為1∶1的次之，三者與研磨法差異不顯著，這可能是由于丙酮 ∶ 乙醇為1∶2混合液中的葉綠素a含量降解較對照慢，光穩定好，且由于不需要進行研磨，只需把葉片剪成小條，對細胞破壞少，形成的降解產物較研磨法少，因此其提取效果及穩定性都較研磨法好。茶葉茶多酚氧化形成的產物可溶于丙酮和水，干擾比色測定，丙酮 ∶ 乙醇為1∶2的混合浸提液由于不加水，且丙酮比例低，干擾較小，所以其提取效果較其它幾種丙酮、乙醇及丙酮、乙醇、水的混合液好。單一溶劑以95%乙醇浸提效果較好。

綜上所述，茶樹大量樣本的葉綠素含量檢測宜選用丙酮 ∶ 乙醇為1∶2的混合液進行提取。由于丙酮為有毒有機溶劑，考慮環保的因素則以95%的乙醇單一溶劑的浸提效果較好。此外，光是影響茶樹葉綠素穩定性的重要因素，所以在茶樹葉綠素浸提、測定及保存時，要盡量選擇避光處理。

[1]薛香, 吳玉娥. 小麥葉片葉綠素含量測定及其與SPAD值的關系[J]. 湖北農業科學,2010,49(11):2701-2702, 2751.

[2]李鵬程, 董合林, 劉愛忠, 等．棉花上部葉片葉綠素SPAD值動態變化研究[J]. 中國農學通報,2012,28(3):121-126．

[3]王愛玉, 張春慶, 吳承來, 等. 玉米葉綠素含量快速測定方法研究[J]. 玉米科學,2008, l6 (2): 97-100.

[4]李得孝, 郭月霞, 吳海燕, 等. 玉米葉綠素含量測定方法研究[J]. 中國農學通報,2005, 21(6):153-155.

[5]張憲政．植物葉綠素含量測定——丙酮乙醇混合液法[J].遼寧農業科學,1986(3) :26-28．

[6]何麗斯, 蘇家樂, 劉曉青, 等. 高山杜鵑葉片葉綠素含量測定及其與SPAD值的關系[J]．江蘇農業科學, 2012, 40(11):190-191.

[7]徐芬芬, 葉利民, 徐衛紅, 等. 小白菜葉綠素含量的測定方法比較[J]. 北方園藝,2010(23) :32-34.

[8]麻明友, 麻成金, 肖桌柄, 等. 獼猴桃葉中葉綠素的提取研究[J]. 食品工業科技,2006,27(6) :140-143.

[9]任紅, 羅豐, 許彥, 等. 菜心葉綠素測定方法比較研究[J].安徽農業科學, 2012,40(3) :1455-1456.

[10]徐華.混合液法測定茶樹葉片葉綠素含量[J]．龍巖師專學報(自然科學版)，1995,13 (3):94-95．

[11]唐茜, 趙先明, 杜曉, 等. 氟對茶樹生長、葉片生理生化指標與茶葉品質的影響[J]. 植物營養肥料學報,2011,17 (1):186-194.

[12]肖潤林, 王久榮, 單武雄, 等. 不同遮蔭水平對茶樹光合環境及茶葉品質的影響[J]. 中國生態農業學報,2007,15(6):6-11.

[13]唐曉波, 劉曉軍, 師大亮, 等. 茶葉中葉綠素含量的季節性差異研究[J]. 浙江農業科學，2007(3): 502-503.

[14]趙先明, 汪艷霞, 杜曉, 等. 茶葉葉綠素混合液浸提法提取條件優化[J]. 西南農業學報,2011,24(4):1303-1308.

Comparisonon Methods of Chlorophyll Extraction in Camellia sinensis

XIANG Fen，LI Wei，LIU Hong-yan，ZHOU Ling-yun，DING Ding，ZENG Zhen
（Tea Research Institure of Hunan Academy of Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China）

In order to find the method for determination of chlorophyll in the leaves of Camellia sinensis, we synthesized the method of chlorophyll determination in others crop, using acetone grinding method as the control, the leaching method was set up 6 treatments as 95% ethanol, 80% acetone，acetone: ethanol=2:1, acetone: ethanol=1:2, acetone: ethanol=1:1, acetone: ethanol: water=4.5:4.5:1, and we tested extraction effect and light stability in the leaves of Camellia sinensis. The results showed that the leaching method including the mixture liquid of the acetone and ethanol with the volume rate of 1:2 could get the best extraction effect and light stability on the chlorophyll in Camellia sinensis, then was acetone: ethanol=2:1 and acetone: ethanol=1:1, the single 95% ethanol also got a good extraction effect. In summary, the method of acetone:ethanol =1:2 is suitable for a large number of samples of the chlorophyll content determination in tea plant, the method is easy to operate and high stability, considering environmental factors, 95% ethanol extraction method is better.

Camellia sinensis, Chlorophyll, Extraction, Determination method

S571.1

A

1009-525X（2016）04-37-40

2016-11-28

2016-12-21

湖南省自然科學基金（2016JJ4052）

向芬（1983-），女，湖南邵陽人，助理研究員，主要從事茶樹栽培學與生理生化方面的研究。