水產生物技術發展戰略研究

陳松林，邵長偉,徐鵬

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島266071；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島266273；3.中國水產科學研究院水產生物技術中心，北京100141）

水產生物技術發展戰略研究

陳松林1,2，邵長偉1,2,徐鵬3

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島266071；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島266273；3.中國水產科學研究院水產生物技術中心，北京100141）

本文從水產養殖生物基因組測序、遺傳連鎖圖譜繪制、重要經濟性狀相關分子標記/基因篩選、基因組編輯、基因組選擇以及細胞培養與種質冷凍保存等方面綜合介紹了水產生物技術的發展現狀，并深入分析了水產生物技術研究中存在的主要問題，諸如基因功能分析平臺不完善，抗病與性控育種技術研究滯后，基因組編輯與全基因組選擇技術剛剛起步等。同時，圍繞上述主要問題，提出了水產生物技術亟待突破的關鍵技術，并建議“十三五”期間設立重點研究計劃專項，深入開展水產動物基因組資源開發與利用、重要經濟性狀遺傳解析以及水產生物信息大數據平臺構建等。

水產；生物技術；基因

DOI 10.15302/J-SSCAE-2016.03.008

一、前言

我國是世界第一大農業生產與消費國，也是世界水產品生產大國，產量連續20多年居世界首位。“國以農為本、農以種為先”，種業作為現代農業發展的第一產業要素，是確保主要農產品有效供給的

重要物質基礎，種業科技的不斷創新已成為提升養殖業核心競爭力的源泉。近年來，伴隨著國家一系列關于“現代種業”“藍色經濟”等戰略性指導方針、規劃的提出，我國水產種業發展迎來了前所未有的重大機遇。

水產生物技術作為水產種業發展的核心技術，涉及到養殖學、遺傳學和育種學等多個學科，從群體、個體、細胞到基因等多種水平，從經典技術到組學技術等多種技術，從魚類、蝦蟹類、貝類到藻類等各類生物，可以說是一個龐大的系統工程。特別是隨著基因組技術的發展，以水產基因組技術為核心的水產生物技術在水產良種培育、苗種繁育、種質保存及病害防控等方面展現出巨大的應用潛力和廣闊的應用前景。現代水產生物技術的研究內容主要包括水產生物全基因組解析和基因資源發掘技術，重要經濟性狀基因鑒定及功能分析技術，基因組編輯、基因組選擇和分子設計技術，水產基因工程產品的研制與利用技術，種質分子鑒定、評估與保存技術等。近年來，國內外在水產生物全基因組測序和精細圖譜繪制上取得很大進展，獲得了海量的基因資源信息，但在重要經濟性狀功能基因鑒定和應用、基因組編輯和基因組選擇、水產動物胚胎批量化保存以及無脊椎動物細胞培養等技術上還存在一些問題，滿足不了水產種業和養殖業發展的需要。我國“十三五”及今后相當長一段時間內水產養殖業的可持續發展對水產生物技術具有重大需求，大力發展以水產基因組技術為核心的水產生物技術研發是我國“十三五”期間的重大研究課題。

二、 水產生物技術發展現狀

（一）水產生物全基因組測序和精細圖譜繪制

近5年來，國內外科學家在水產養殖生物全基因組測序和精細圖譜繪制方面取得了一些重大進展。國外相繼完成了大西洋鱈[1]、三棘刺魚[2]、藍鰭金槍魚[3]、七鰓鰻[4]、腔棘魚[5]、虹鱒[6]和羅非魚[7]等水產動物的全基因組測序和精細圖譜繪制。

國內，中國科學院海洋研究所牽頭完成了長牡蠣全基因組測序和精細圖譜繪制，并揭示了潮間帶逆境適應的分子機制[8]；中國水產科學研究院黃海水產研究所牽頭完成了半滑舌鰨全基因組精細圖譜繪制，并揭示了ZW性染色體起源和進化以及適應底棲生活的分子機制[9]，這也是世界上第一個完成全基因組精細圖譜繪制的比目魚類；中國水產科學研究院黑龍江水產研究所牽頭完成了鯉魚全基因組測序和遺傳多樣性分析[10]；浙江海洋大學牽頭完成了大黃魚全基因組測序和精細圖譜繪制[11]；中國科學院水生生物研究所牽頭完成了草魚全基因組測序和精細圖譜構建[12]；深圳華大基因研究院牽頭完成了彈頭魚全基因組測序[13]；中國科學院海洋研究所完成了桔黃東方鲀全基因組測序[14]。此外，中國水產科學研究院黃海水產研究所完成了海帶全基因組圖譜的繪制[15]。上述水產生物全基因組結構的解析為篩選重要性狀相關功能基因提供了基因資源。

（二）水產養殖生物重要性狀相關功能基因發掘

在水產養殖動物性別決定、抗病免疫、生殖發育等相關基因篩選與鑒定方面國內外也取得了重要進展。近5年來，國外科學家在多種魚類上發現了性別決定基因，例如，青鳉的dmy基因、銀漢魚的amhy基因、河豚的amhr2基因、呂宋青鳉的gsdf基因、虹鱒的sdY 基因[16～20]。

國內，中國水產科學研究院黃海水產研究所克隆與表征了半滑舌鰨性別決定和生殖相關的10多個基因[21～23]，特別是發現dmrtl基因是半滑舌鰨Z染色體連鎖、精巢發育必不可少的雄性決定基因[9]。西南大學克隆了羅非魚雄性性腺發育必不可少的基因amhr[24]。在抗病免疫相關基因篩選方面，國內多家單位都開展了不同水產養殖生物抗病免疫相關基因克隆的研究， 其中，代表性的單位包括：中國科學院水生生物研究所解析了鯽魚干擾素系統關鍵基因的抗病毒作用機理[25～28]，中國水產科學研究院黃海水產研究所和中國科學院海洋研究所等單位克隆與表征了大菱鲆stat2、grim-l9、牙鲆akirinl、hepn、clq，半滑舌鰨ghClq、irfl等一批抗病免疫相關基因[29～34]。

（三）水產養殖生物高密度遺傳連鎖圖譜繪制

近5年來，水產養殖動物高密度遺傳連鎖圖譜的構建主要采用單核苷酸多態性（SNP）標記進行，目前已在多種水產養殖動物構建了高密度單核苷酸多態性遺傳圖譜。 國外，利用5 950個單核苷酸多態性標記構建了大西洋鮭高密度遺傳圖譜[35]；利用

2 226個單核苷酸多態性標記構建了虹鱒高密度遺傳圖譜[36]；利用2 235個單核苷酸多態性標記構建了墨西哥脂鯉高密度遺傳圖譜，標記間平均距離為0.94 cM[37]；構建了斑點叉尾高密度單核苷酸多態性遺傳連鎖圖譜[38]。

國內，中國水產科學研究院黃海水產研究所構建了半滑舌鰨高密度單核苷酸多態性遺傳連鎖圖譜，定位單核苷酸多態性標記12 142個[9]，平均圖距為0.326 cM；構建了牙鲆高密度單核苷酸多態性遺傳連鎖圖譜，平均圖距為0.47 cM[39]；構建了大菱鲆高密度單核苷酸多態性遺傳圖譜，平均圖距為0.4 cM[40]。中國水產科學研究院黑龍江水產研究所構建了鯉魚微衛星遺傳連鎖圖譜，共包含1 025個標記[41]。中國科學院海洋研究所構建了海灣扇貝高密度微衛星遺傳連鎖圖譜[42]和南美白對蝦高密度單核苷酸多態性遺傳連鎖圖譜，標記間距達0.7 cM[43]。中國海洋大學構建了扇貝高密度單核苷酸多態性遺傳連鎖圖譜，平均圖距為0.41 cM[44]。此外，中國海洋大學還構建了海帶高密度單核苷酸多態性遺傳圖譜，平均圖距為0.362 cM[45]。

（四）水產養殖生物重要性狀相關分子標記篩選與應用

國內外近幾年來對水產養殖動物重要性狀相關分子標記的篩選非常重視，其中歐盟國家對魚類性別特異分子標記篩選投資很大，例如，法國主導啟動了20多種養殖魚類性別特異分子標記篩選的項目研究。美國發現了斑點叉尾雄性特異分子標記AUEST0678[46]。此外，法國科學家利用模式藻類水云性別決定區域的序列，開發了掌狀海帶、裙帶菜和巨藻的性別特異分子標記[47]。而在抗病相關分子標記篩選方面，初步篩選出與虹鱒抗細菌性冷水病 (CWD) 的12個相關標記以及與傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)相關的19個單核苷酸多態性標記[48]。發現大菱鲆與盾纖毛蟲病相關的微衛星標記Sma-USC256[49]；發現斑節對蝦抗白斑病（WSD）相關的RAPD-SCAR標記1個[50]。

國內近幾年來在魚類性別特異分子標記篩選方面取得了重要進展，篩選出半滑舌鰨和黃顙魚等多種魚類性別特異擴增片段長度多態性（AFLP）標記和微衛星標記[51]。其中，中國水產科學研究院黃海水產研究所篩選出半滑舌鰨雌性特異擴增片段長度多態性標記和微衛星標記，發明了鑒別雄魚、偽雄魚、雌魚和超雌魚遺傳性別的聚合酶鏈式反應（PCR）技術，研制了半滑舌鰨高雌性苗種制種技術，將苗種的生理雌魚比例提高了20 %以上[9,52,53]。中國科學院水生生物研究所篩選出黃顙魚雄性特異擴增片段長度多態性標記，建立了黃顙魚遺傳性別鑒定的聚合酶鏈式反應（PCR）方法[54]。浙江海洋大學篩選出條石鯛雄性特異分子標記，建立了條石鯛遺傳性別鑒定技術[55]。上海海洋大學利用熒光原位雜交篩選出海帶雌性特異標記[56]。在水產養殖動物抗病相關分子標記篩選方面報道較少，其中黃海水產研究所篩選出牙鲆抗鰻弧菌病相關微衛星標記[57]。

（五）全基因組選擇技術

基因組選擇（GS）是挪威科學家Meuwissen在21世紀初期提出的方法。這一方法是以覆蓋整個基因組的單核苷酸多態性標記信息為基礎，能夠鑒定出導致目標性狀表型的所有遺傳變異，可以同時選擇抗病、高產、抗逆等多種經濟性狀，達到多性狀選育的分子育種模式。這個方法特別適合于低遺傳力的數量性狀，例如抗病、抗逆等性狀。全基因組選擇技術在禽、牛和豬等養殖動物上得到應用并產生了很好效果。而在水產養殖動物上，由于全基因組測序的滯后，迄今國際上有關魚類全基因組選擇育種大多停留在理論研究，投入實際應用的還很少。其中，挪威科學家進行了大西洋鮭感染病原前后存活魚和死亡魚基因表達譜的比較研究，通過模擬計算，預測經6～7代選擇后抗病力有可能提高1倍[58]。美國奧本大學開發了250 K的斑點叉尾鮰單核苷酸多態性標記的基因芯片，推進了全基因組選擇在鯰魚育種中的應用[59]。挪威、美國等國家目前啟動了大西洋鮭、虹鱒魚等抗病全基因組選擇的項目研究。

“十二五”期間，我國啟動了半滑舌鰨、大黃魚、櫛孔扇貝和對蝦基于全基因組信息的遺傳選育的課題研究，其中中國海洋大學建立了扇貝全基因組選擇技術平臺；中國水產科學研究院黃海水產研究所完成了半滑舌鰨和牙鲆抗病參考群體的構建及全基因組重測序，計算了全基因組單核苷酸多態性標記的遺傳效應和基因組估計育種值（GEBV）；集美大學開展了大黃魚生長性狀的全基因組選擇技術

研究。上述進展為建立這些種類的全基因組選擇育種技術奠定了重要基礎。

（六）水產養殖生物基因組編輯技術

基因組編輯技術是近幾年來發展起來的對基因組進行精確修飾的一種先進技術，主要包括轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9兩項技術。這些基因組編輯技術在模式魚類斑馬魚和青鳉上成功建立并得到應用[60,61]。 有關水產養殖動物基因組編輯技術的成功報道目前還很少。Edvardsen 等[62]采用CRISPR/Cas9技術對大西洋鮭色素沉積相關的兩個基因tyrosinase和slc45a2進行了定點修飾，導致突變體在幼魚階段相比野生型魚減少了色素沉積。

西南大學通過轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術敲除了羅非魚性別相關的2個基因dmrtl和foxl2，揭示了這兩個基因在羅非魚性別分化過程中的功能[63]。蘇州大學建立了鯉魚轉錄激活因子樣效應物核酸酶和CRISPR/Cas9基因組編輯技術，并對sp7、runx2、sppl和mstn基因進行了定點突變，研究了這些基因在鯉魚肌間刺形成中的作用[64]。黃海水產研究所成功建立了海水鲆鰈魚類半滑舌鰨受精卵顯微注射和轉錄激活因子樣效應物核酸酶基因組編輯技術，采用該技術成功將雄性決定基因dmrtl進行了突變，并觀察到突變后的遺傳雄魚生長變快，接近正常雌魚[65]。隨著越來越多的水產動物的基因組被測序，它們的基因組功能研究會顯得日益重要。基因組編輯是基因功能研究和基因組改造的一個重要手段。在水產領域，基因組編輯技術還處于研究的初期階段，但其在基因敲除和基因組育種方面已經表現出巨大潛力，將對水產動物基因功能研究和遺傳改良產生深遠影響。

（七）水產動物細胞培養

近幾年來，國外在水產養殖動物細胞系建立方面取得一些進展。如印度建立了熱帶觀賞魚Puntius fasciatus 和 Pristolepis fasciata的尾鰭細胞系[66]，建立了南亞野鯪魚鰓組織細胞系等[67]。特別是在水產無脊椎動物細胞培養上進行了一些有益探索，并取得可喜進展。Jayesh 等[68]研制出一種斑節對蝦細胞的施旺細胞培養液（SCCM），班節對蝦淋巴和卵巢細胞分別傳了2代。 Mercurio等進行了海膽卵巢組織的原代培養[69]。

近5年來，我國在水產養殖動物細胞系建立上取得一些進展，新建立了多種魚類組織細胞系，陳松林等主編出版了《魚類細胞培養理論與技術》專著[70]。其中黃海水產研究所建立了3個半滑舌鰨組織細胞系，包括卵巢細胞系[71]， 偽雄魚性腺細胞系[72]以及神經膠質細胞系[73]；建立了1個云紋石斑魚心臟細胞系[74]。

（八）水產養殖動物種質冷凍保存

在水產養殖動物精子冷凍保存方面，國外已進入商業化應用階段。其中精子冷凍保存技術在大西洋鮭種業發展和苗種推廣中起到重要作用，挪威的大西洋鮭苗種繁育實行了采用冷凍精子授精魚卵批量化生產魚苗的生產模式。 美國路易斯安那州立大學建立了魚類精子高效冷凍保存技術，3個人每天可以冷凍保存1 000管凍精的任務。 在魚類胚胎冷凍保存方面，伊朗科學家采用玻璃化冷凍方法，將波斯鱘魚胚胎在液氮中冷凍保存后復活，成功獲得冷凍復活的胚胎，最高復活率達69 %[75]， 從而證明玻璃化冷凍方法在魚類胚胎超低溫冷凍保存上的可行性和應用潛力。

國內近幾年來不僅建立了性逆轉七帶石斑魚、抗病牙鲆和抗病半滑舌鰨優良家系的精子冷凍保存技術和精子庫，而且在石斑魚冷凍精子產業化應用方面取得較大進展，實現了魚類冷凍精子的產業化應用。在水產動物胚胎冷凍保存方面，自2005年我國首次突破海水魚類牙鲆胚胎玻璃化冷凍技術，并在–196℃液氮溫區獲得冷凍復活且孵化出魚苗的牙鲆胚胎以來，國內一些學者又相繼在其他魚類獲得冷凍復活的胚胎，例如，采用玻璃化技術在七帶石斑魚上獲得了14粒冷凍復活胚胎，其中2個凍胚孵化出魚苗[76]。

三、水產生物技術研究中存在的主要問題

（一）基因組資源開發進展迅速，但水產養殖動物基因功能分析平臺尚未建立，滿足不了基因功能研究的需要

近年來我國學者相繼完成牡蠣、半滑舌鰨、鯉魚、草魚和大黃魚等的全基因組測序，成果陸續在《Nature》《Nature Genetics》等頂級期刊上發表。然而，

在后基因組時代，重點將是基因功能驗證和重要性狀的遺傳解析。但絕大多數水產養殖動物，我國尚未建立轉錄激活因子樣效應物核酸酶和CRISPR/ Cas9等基因組編輯技術和平臺，嚴重影響了重要性狀關鍵基因的發掘及其在遺傳育種和水產養殖業中的應用。

（二）水產養殖動物抗病基礎研究及抗病分子育種研究投入低、進展慢，滿足不了產業發展的需求

抗病良種培育是我國水產養殖業提質增效的重要途徑。然而由于對水產養殖動物抗病基因的功能及其調控機制的認識不足，限制了水產養殖動物抗病分子育種的研究進程，滿足不了水產業對抗病高產良種的需求。

（三）性別特異分子標記和分子輔助性控技術研究滿足不了魚類養殖業發展的需求

水產動物中雌雄個體在產量性狀方面的性別差異非常普遍，因此性別控制育種和相關性別決定基礎研究是水產前沿技術研究的重要內容。盡管目前已經發現半滑舌鰨、黃顙魚、羅非魚、圓斑星鰈和條石鯛的性別特異分子標記，并進行了產業化應用，但是，在許多其他水產養殖動物尚未開發出性別特異分子標記，分子性控育種研究也比較滯后。

（四）基因組選擇剛剛起步，離良種選育應用尚有距離

基因組選擇將成為今后水產養殖動物育種的重要手段之一， 但目前只在少數水產養殖動物上進行了前期研究，距離建立全基因組選擇育種技術并在產業中進行應用仍然有相當距離，需要加大投入，重點突破。

四、水產生物技術發展戰略與關鍵技術

（一）發展戰略

以服務于水產養殖業創新驅動戰略，提高現代漁業科技競爭力為主要目標，加快水產生物技術的原始創新研究，圍繞水產重要經濟物種基因組結構和功能解析、經濟性狀調控網絡、基因組育種技術體系以及種質資源評價與保護，力爭在理論方面有重大發現，在關鍵共性技術方面有所突破，支撐和引領水產種業發展，為建設水產生物技術強國、引領世界水產養殖業發展、實現我國從水產養殖大國向水產養殖強國邁進做出貢獻。

（二）關鍵技術

1. 水產生物高復雜度基因組的組裝和分析技術

水產生物高復雜度基因組的組裝和分析技術主要包括高雜合度、高重復序列水產生物的全基因組或性染色體基因組拼接、組裝及生物信息學分析技術。

2. 重要水產養殖動物基因組編輯技術

重要水產養殖動物基因組編輯技術主要包括水產養殖動物（魚、蝦、蟹、貝等）基因組編輯（轉錄激活因子樣效應物核酸酶和CRISPR/Cas9）技術以及基因組編輯平臺。

3. 水產動物重要經濟性狀關鍵基因及分子標記篩選與鑒定技術

水產動物重要經濟性狀關鍵基因及分子標記篩選與鑒定技術包括水產養殖動物生長、抗病、性別決定等重要性狀相關分子標記和關鍵基因的篩選與鑒定技術。

4. 水產動物基因組選擇和分子設計技術

水產動物基因組選擇和分子設計技術主要包括水產養殖動物抗病、抗逆和品質性狀的全基因組選擇和分子設計技術。

五、水產生物技術發展建議

鑒于水產生物技術在我國水產種業和水產養殖業可持續發展中的重要意義和應用潛力，考慮到國內外目前的發展現狀和存在問題，建議我國圍繞如下幾個方面設立重點研究計劃專項。

（一）水產養殖生物全基因組結構解析及基因資源的深度挖掘

進行魚、蝦、貝、蟹、藻等重要水產養殖生物全基因組測序和精細圖譜構建，分析不同水產生物基因組的結構特征和進化規律，闡釋不同水產養殖生物基因組的結構和功能，進行基因資源的深度挖掘。

（二）水產養殖生物重要經濟性狀的遺傳解析及分子設計的基礎研究

建立水產養殖生物基因組編輯公共平臺和技術

體系，篩選重要水產養殖生物生長、抗病、性別、環境適應等性狀關鍵基因；開展抗病、抗逆和品質性狀的全基因組關聯分析和基因組選擇及分子設計的基礎研究；構建水產養殖生物重要基因高效重組表達技術體系，研制基因工程重組蛋白；探索重組表達產物提高水產養殖動物生長速率和抗病力的途徑。

（三）重要水產養殖生物經濟性狀形成的表觀遺傳與環境調控機制

以水產養殖生物生長、生殖、發育和免疫等重要經濟性狀為目標性狀，通過基因組甲基化分析、組蛋白修飾以及小核糖核酸（RNA）分析等技術手段解析環境因素介導的重要經濟性狀形成的表觀遺傳調控機制；建立甲基化修飾因子在水產動物中的檢測技術體系，篩選與重要經濟性狀相關的表觀標記。

（四）重要水產養殖生物基因信息大數據平臺構建及應用

構建以種質資源數據和基因組數據為核心的水產生物基因資源信息大數據平臺，收集、儲存和分析我國重要水產養殖物種豐富多樣的種質資源和基因資源信息；通過數據的加工和大數據分析，為水產生物技術研發、遺傳育種、病害防治和資源保護等提供必要的數據支撐。

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Development Strategy for Fisheries Biotechnology

Chen Songlin1,2, Shao Changwei1,2, Xu Peng3
(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, Shandong , China; 2. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266273, Shandong, China; 3. Centre for Aquaculture Biotechnology, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China)

The recent developments in fisheries biotechnology are reviewed in this paper, including aquatic animal genome sequencing, genetic mapping construction, screening of molecular marker or genes for economically important traits, genome editing, genomic selection, and cell culture and germplasm conservation. The main problems addressed in the study of fisheries biotechnology are also analyzed, including the incomplete gene function analysis platform, the hysteresis of breeding techniques on sex control and disease resistance, the ongoing of genome editing and genomic selection and so on. The key technological breakthroughs that are needed to solve these problems are outlined. Meanwhile, this paper proposes a key major research project to be implemented, during the 13th Five Year Plan, in order to develop and utilize aquatic animal genome resources, analyze their commercially important genetic traits, and construct a megadata platform for aquatic organisms.

fisheries; biotechnology; gene

Q78

A

2016-04-27；

2016-05-15

陳松林，中國水產科學研究院黃海水產研究所，研究員，研究方向為水產生物技術和遺傳育種；E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

中國工程院重點咨詢項目 “水產養殖業十三五規劃戰略研究”(2014-XZ-19-3)；國家自然科學基金重點項目(31130057)；山東省泰山學者攀登計劃專家項目

本刊網址：www.enginsci.cn