農村污水膜生物反應器系統中微生物群落分析

王常婕，靳 衛

（營口職業技術學院，遼寧營口 115000）

農村污水膜生物反應器系統中微生物群落分析

王常婕，靳 衛

（營口職業技術學院，遼寧營口 115000）

近年來，隨著農村經濟的不斷發展，農村污水的排放量不斷增加，加之不加限制的灌溉回用最終造成水源污染日益嚴重，其中，水源中的病原微生物直接影響居民的健康問題，為了有效解決這種問題，采用污水膜生物反應器系統對農村污水中的微生物群落進行了分析，以期對相關研究提供理論依據。

農村；污水膜生物反應器；系統；微生物群落

農村污水中具有大量病原微生物，對這些微生物群落進行細致分析便于細分主要的病原菌，從而為評估水源風險，提出具體解決措施提供數據依據[1]。為了進一步了解該系統的應用價值和應用作用，本文對其具體的應用過程進行了分析，現將研究內容論述如下。

1 材料與方法

1.1 采集樣品

圖1 污水膜生物反應器系統工藝流程

污水膜生物反應器系統每日的處理量約為600m3。使用聚乙烯容器采集1～5L深層水水樣。在水樣采集前使用10% 的鹽酸浸泡采集容器，然后進行反復沖洗，經由蒸餾水清洗干凈后將其置于烘箱中烘干備用。之后將水樣保存于4℃環境內，在24h內送檢檢測其水質參數。接下來，將采集的水樣置于4℃的冰盒內，取2L再生水和100mL原污水，使用真空抽濾裝置進行過濾，同時低速離心收集其他水樣，水樣各取 5mL，進行沉淀，最后，對沉淀和濾膜中的物質進行-20℃冰箱存儲，以便進行微生物分析。

1.2 使用儀器

DZB-718 便攜式多參數分析儀、H165-W高速離心機、ND-2000核酸蛋白測定儀、BOX 凝膠成像系統、BG-Power 600i電泳儀、Strata gene Mx3005P 實時熒光定 量 PCR 儀、電子天平、B5200DT 超聲波清洗機等。

1.3 提取基因組的DNA使用無菌剪刀將濾膜剪碎，依照具體步驟用試劑盒提取其總基因組的DNA，具體步驟為將5μL 基因組 DNA 溶液進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對其濃度進行測定，最后保存在冰箱中，冰箱溫度控制在-20℃。

1.4 建立16SrDNA 基因克隆文庫

1.4.1 PCR擴增

將基因組 DNA設為模板，使用16SrDNA 基因的通用引物進行PCR擴增，建立50μLPCR 反應體系。體系包括1μL DNA模板、4μLdNTP、5μL 10×PCR buffer、1UTaq DNA 聚合酶，將滅菌后的 ddH2O補充至 50μL。其中，PCR的反應基本條件如下：95℃下預變性10min，而同樣溫度下變性45s，在55℃時退火處理1min，在72℃時延伸45s，進行循環，次數為35次。于72℃時延伸 10min，進行4℃環境下保持。將PCR擴增形成的物質使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

咸豐十年(1860)，俄國迫使清朝簽訂《中俄北京條約》，強行規定設在中國境內的卡倫為分界線，指定了中俄西段邊界的走向，為更多地割占塔爾巴哈臺、伊犁和科布多等領土制造了條約依據。

1.4.2 克隆、轉化16SrDNA基因，建立文庫

將PCR擴增物質使用儀器進行純化，將其中的DNA 片段于4℃ 條件下同pGEM-T Easy Vector連接16h，然后導入大腸桿菌 DH5α，置于液體 LB在37℃時進行培養，時間為3h，隨后將100μL 在LB平板上進行涂布，培養18h，之后篩選藍白斑。將其中白色單菌落培養后用載體引物進行 PCR擴增。經由檢測后選出陽性克隆子，建立16S rDNA 基因文庫。由于細菌較多，所以選取其中的116個陽性克隆子進行擴展，之后進行酶切分型和電泳。接下來，進行EB 染色和蒸餾水漂洗。用成像系統存儲結果。對圖像結果進行分析，明確ARDRA 的類型的數目，最后，進行測序。

1.4.3 分析基因克隆文庫

使用相關網站和軟件分析并去除嵌合體，如果核酸相似性大于97%的水平，對操作分類單元（OTU）進行劃分[2]。其中，基因文庫的多樣性覆蓋率使用公式進行計算。公式為C=1-n1/N（C代表多樣性覆蓋率，n1代表一個克隆的 OTU，N表示基因文庫的克隆數）。分值越高說明文庫的多樣性覆蓋率越高。而基因文庫的序列指數分析使用H和D指數進行計算，H代表Shannon-Wiener 指數，D代表Simpson指數。

1.4.4 建立系統發育樹

使用Blast 對NCBI 數據庫和測序成功的陽性克隆序列進行同源性檢索，通過鄰接法建立系統發育樹，評估其穩定性，使用非參數支持率計算樹的節點。

1.5 分析T-RFLP

對水樣基因組DNA進行擴增。其擴增條件為于95℃ 下預變性5分值，同溫下變性45s，然后在50℃下退火45s，隨后在72℃下延伸 1min后進行循環，次數為30次，之后在同溫下延伸10min，進行4℃保持[3]。將兩次擴增物質進行混合后純化，純化后進行酶切最后對圖譜進行分析，依照圖譜對微生物的群落結構的多樣性進行分析。

1.6 對PCR進行熒光定量

行常規擴增、純化、載體連接、導入感受態細胞 DH5α、篩選涂板、LB液體培養、提取質粒、測定質粒濃度、檢測基因定量。

2 結果與分析

2.1 水質指標及污水處理情況

經檢驗，總氮、COD、總磷和氨氮去除率分別為20.8%、91.6%、21.8%、97.4%未檢出亞硝態氮，其中溶解氧、硝態氮和電導率穩定。在出水中沒有檢測出蛔蟲卵和大腸菌群。其中的糞大腸菌群≤3 個/L。所有出水指標符合《城鎮污水處理廠污染物排放標準》。

2.2 基因克隆文庫

116個陽性克隆經酶切分型后共有14個OTU能夠用來測序，測序成功72個陽性克隆和10個OTU，經檢測16S rDNA基因克隆文庫中的細菌物種均勻度為 0.81，多樣性指數為1.85，這說明污水中優勢菌種比例相對較高。就本次研究的克隆文庫的覆蓋度為 0.988，這說明微生物的種類占全部微生物種類的比例較高。經 OTU 序列BLAST 比對可知，本次研究的細菌的 16S rDNA 基因序列相似性范圍為93%～99%。變形菌門、ε-變形菌綱、β-變形菌綱比例為 91.9%、71.1%和20.4%。在此次研究中弓形菌比例較高，這主要源于病原菌生長適應性強所致。此外，未培養細菌、厚壁菌門、擬桿菌門比例為4.11%、2.71%和1.41%，這說明農村污水中細菌較為多樣性。

2.3 T-RFLP 結果

分析細菌群落的T-RFLP 圖譜，其中，好氧池、調節池、膜生物反應池中的群落結構穩定，T-RFs 片段數量較多。這三個系統中調節池中的 Shannon-Wiener 物種豐度、多樣性指數、均勻度最高，這個系統可以為微生物生長提供繁殖條件，具有很好的調節、緩沖作用。在該系統后所有指數均不斷遞減。

2.4 病原菌定量結果

污水中弓形菌具有一定的優勢，經菌屬和總數分析可知其擴增效率高達100%，相關系數也均在99% 以上，符合定量要求。

3 結束語

綜上所述，農村污水中微生物群落的結構極為復雜，其物種分配均勻、多樣性較高，就本次研究結果顯示，變形菌門是種類最豐富、數量最多的細菌類群，除此之外還有一系列的多種細菌。經污水膜生物反應器系統處理過后的出水物化指標較高。今后的污水處理不僅要采取污水處理技術，同時還需結合適當的灌溉方式，綜合降低水灌溉后病原菌的風險，從而保障農村生態環境。而就本次研究而言，研究內容仍然不夠全面，今后筆者將進行深入的研究與分析，旨在進一步提高對微生物群落的認知。

[1] 孔曉，崔丙健，金德才，等.農村污水膜生物反應器系統中微生物群落解析[J].環境科學，2015（9）：3329-3338.

[2] 吳鵬，陸爽君，徐樂中，等.溫度對ABR-MBR復合工藝處理生活污水的影響及其微生物群落分析[J].環境科學，2014（9）：3466-3472.

[3] 李軍，喬文燕，王朝朝，等.處理垃圾滲濾液復合式膜生物反應器中微生物群落結構的演變和分析[J].北京工業大學學報，2010，37（8）：1111-1117.

Analysis of Microbial Communities in Membrane Bioreactor System of Rural Wastewater

Wang Chang-jie，Jin Wei

In recent years，with the continuous development of rural economy，the discharge of sewage in rural areas is increasing，and the unrestricted irrigation reuse eventually leads to the increasingly serious water pollution，in which the pathogenic microorganisms in water directly affect the health of water users In order to effectively reduce this problem，this paper uses the sewage membrane bioreactor system to analyze the microbial community in the rural sewage，and provide the theoretical basis for the related research.

village；sewage membrane bioreactor；system；microbial community

X172

A

1003–6490（2016）10–0116–02

2016–12–05

王常婕（1980—），女，遼寧營口人，講師，主要研究方向為環境工程。