Hg2+對花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲口器致畸作用及抗氧化酶活性的影響

陳菲，劉曼紅，蔡艷，馬玉堃

（東北林業大學野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

Hg2+對花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲口器致畸作用及抗氧化酶活性的影響

陳菲，劉曼紅，蔡艷，馬玉堃

（東北林業大學野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

在水溫（17.0±1.0）℃和16h光∶8h暗的光周期下，采用加標于沉積物法研究Hg2+對花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲口器的致畸作用和抗氧化酶活性的慢性毒性影響。將4齡搖蚊幼蟲暴露于0.002mg· L-1、0.004 mg·L-1、0.008mg·L-1、0.016mg·L-1、0.032mg·L-1、0.064mg·L-1、0.128mg·L-1和0.256mg·L-18個Hg2+濃度梯度下，測定搖蚊幼蟲組織勻漿超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性。結果表明：Hg2+顯著影響花翅搖蚊幼蟲體組織SOD和CAT活性，且與Hg2+暴露濃度呈顯著濃度-效應關系（P＜0.05）。Hg2+暴露30d后，搖蚊幼蟲的大顎長度與Hg2+暴露濃度之間也呈極顯著正相關性（P＜0.01）。該結果說明在低濃度Hg2+的脅迫下，搖蚊幼蟲形態結構、生理功能發生了顯著改變，可用該幼蟲的形態結構、生理功能指標作為監測水體Hg2+污染及判定水環境質量的生物學指標。

Hg2+；花翅搖蚊幼蟲；抗氧化酶；致畸作用

大氣和土壤中的Hg2+可通過干濕沉降以及地表徑流等進入水體中而普遍存在[1]，再通過生態系統食物鏈逐級傳遞，影響水的質量、水生生物包括魚類的生存，威脅到人類的健康。因此，檢測水體中Hg2+的存在及其在環境中的影響尤為重要。

研究表明，可以用水生生物的形態結構和生理特征等生物學指標的變化來評估水生生態環境的污染情況[2,3]。底棲動物是水生生物的重要組成類群，在水生生態系統中發揮重要作用，它們的形態結構和生理指標能反應水體環境健康狀況。張傳永等[4]研究發現，水生動物通過呼吸、攝食、體表與水體的滲透交換富集水體重金屬。底棲動物常受水體污染的影響[5]，形態結構和生理特征產生相應變化，因此，通常用水生生物監測環境。搖蚊幼蟲是淡水生態系統中最常見的底棲動物，在激流和靜水的底棲生物群落環境中占主導地位[6]，是其他水生生物的主要食物來源[7]。搖蚊幼蟲體內的重金屬可以通過食物鏈傳遞給下一營養級，生物放大作用使水生生態系統中的高位營養級生物體內重金屬含量增多，使生物體生理受阻、發育停滯，甚至死亡，最后造成整個水生生態系統的結構和功能受損和崩潰[8]。因此，搖蚊幼蟲在水生生態系統中居基礎地位，研究搖蚊幼蟲對水體Hg2+脅迫的響應，有助于對水體Hg2+污染做出快速反應，以免危害水生生物以及人類健康。

搖蚊幼蟲對水質變化較敏感，污染使口器或觸角發生形態變化[9]，可在高污染環境下生存[10]。因此，搖蚊幼蟲是水生態毒理實驗重要的研究對象，也是監測河流和湖泊水質的重要指示生物之一[9,11]。其中，花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲是研究應對不同曝光時間層次的重金屬污染的好材料[12]，尤其是對水體Hg2+濃度的變化。

目前關于搖蚊幼蟲的慢性毒理實驗鮮見研究。閆賓萍等[13]研究了Ni2+、Hg2+和五氯酚對羽搖蚊Chironomus plumosus幼蟲的急性毒性。李浩等[14]研究了Cu2+對羽搖蚊幼蟲口器致畸作用和抗氧化酶活性的急性毒理性。劉曼紅等[15]研究了Hg2+慢性脅迫對花翅搖蚊幼蟲組織三種酶活性的影響。本研究采用低劑量Hg2+（濃度小于0.729mg·L-1）慢性毒物暴露實驗方法，進一步探測亞致死劑量的Hg2+暴露對花翅搖蚊幼蟲口器致畸及體內超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的影響，為水環境Hg2+污染的早期診斷及生態風險評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試花翅搖蚊幼蟲由東北林業大學野生動物資源學院水生生物學實驗室室內長期培養。實驗用水為人工介質M4[8]，水溫為（17.0±1.0）℃。選取個體活潑、體長一致的3～4齡幼蟲，在人工介質M4中馴養24h后進行急性毒性實驗，以此確定慢性毒理實驗中Hg2+的安全濃度。在慢性毒理實驗中，供試花翅搖蚊幼蟲卵帶與上述幼蟲選自同一培養箱內，選取完整的卵帶3條，投入附水沉積物[8]即模擬水生態系統中進行毒理實驗。

1.2 方法

1.2.1 安全濃度的確定

參照《化學品沉積物-水系統中搖蚊毒性實驗加標于沉積物法》[8]進行暴露。用人工介質M4配制實驗溶液，在預實驗基礎上設置1.0mg·L-1、1.4mg· L-1、1.8mg·L-1、2.2mg·L-1、2.6mg·L-1和3.0mg·L-16個Hg2+質量濃度組。每組設三個平行，設空白對照組。實驗期間給搖蚊幼蟲投喂金魚幼魚飼料，水環境pH（6.0±0.5），水溫為（17.0±1.0）℃，t(光)∶t(暗)=16h∶8h。觀察各實驗組搖蚊幼蟲存活情況，挑出死亡個體，統計死亡率。搖蚊幼蟲死亡標準為：用玻璃棒輕壓尾部3次后無“8”字扭動運動現象。用線性回歸法[17]計算暴露24h時Hg2+對花翅搖蚊幼蟲的半數有效濃度（EC50）。

根據安全濃度（ρS）計算公式ρS=ρ（24h,EC50）×0.1[18]和急性毒性實驗的半數有效濃度（EC50），確定慢性毒性實驗中Hg2+的安全濃度。參照花翅搖蚊幼蟲的ρ（24h,EC50）值，慢性實驗中設0.002mg·L-1、0.004mg·L-1、0.008mg·L-1、0.016mg·L-1、0.032mg·L-1、0.064mg·L-1、0.128mg·L-1和0.256mg·L-18個Hg2+濃度梯度，每組設三個平行，設空白對照組。實驗期間不投餌，水環境中的沉積物為搖蚊幼蟲的食物來源。水pH（6.0±0.5），水溫（17.0±1.0）℃，t(光)∶t(暗)=16h∶8h，用空氣泵充氣以保證水環境內氧氣充足。

1.2.2 抗氧化酶活性的測定

花翅搖蚊幼蟲在不同濃度Hg2+中暴露30d后，每組隨機選取10只活潑、體長一致的4齡幼蟲，用預冷的蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干體表水分。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定花翅搖蚊幼蟲組織均漿液的SOD和CAT活性。

1.2.3 Hg2+對搖蚊幼蟲口器結構的影響

在搖蚊幼蟲發育為4齡幼蟲后，選取大小相近的活潑個體，用沸水燙死，剝離幼蟲頭部進行鏡檢，利用Motic Images Plus 2.0拍攝，測量其大顎長度。

采用SPSS16.0統計軟件對各組間各指標作單因素方差分析（ANOVA），采用t檢驗法分析各濃度組與對照組間的差異顯著性。所有數據處理和作圖均采用SPSS16.0統計軟件和Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Hg2+脅迫對花翅搖蚊幼蟲體組織中SOD活性的影響

由圖1可知，花翅搖蚊卵帶在Hg2+中暴露30d后，隨著Hg2+濃度的升高，SOD活性先快速降低，顯著低于對照組；但從0.002mg·L-1組開始，各濃度組SOD活性開始緩慢上升，0.016mg·L-1組顯著高于對照組，受誘導顯著（P＜0.05）；0.064mg·L-1Hg2+暴露組SOD活性達峰值，受誘導極顯著（P＜0.01）。隨Hg2+濃度的繼續升高（0.128mg·L-1），SOD活性開始下降，不同處理組之間差異顯著（P＜0.05）。

圖1 Hg2+對花翅搖蚊幼蟲體組織中SOD活性的影響Fig.1 Effect of Hg2+on SOD activity in tissues of larval chironomus Chironomus kiiensis

2.2 不同濃度Hg2+脅迫對花翅搖蚊幼蟲體組織中CAT活性的影響

花翅搖蚊卵帶經Hg2+暴露30d后，隨著Hg2+濃度的升高，CAT活性快速升高，顯著高于對照組，受誘導顯著（P＜0.05），在0.004mg·L-1Hg2+組達到峰值，隨后活性開始緩慢下降，CAT活性從0.008mg·L-1Hg2+組開始顯著低于對照組，差異顯著（P＜0.05）。隨后，CAT活性隨著 Hg2+濃度增加逐漸降低，0.256mg·L-1Hg2+組下降到最低（圖2）。

2.3 Hg2+脅迫對花翅搖蚊幼蟲口器畸變的影響

經不同濃度Hg2+暴露后，花翅搖蚊幼蟲頦部未發生畸變，但是大顎的齒部長度隨著Hg2+濃度的升高而變長（圖3）。在顯微鏡下，測定各處理組搖蚊幼蟲大顎長度，利用SPSS16.0將大顎長度（y）與各處理組Hg2+濃度進行線性回歸分析，其回歸方程為：y（μm）=0.985+2.443x（mg·L-1）（R2=0.754）。結果表明，大顎長度（y）與Hg2+暴露濃度（x）之間呈極顯著正相關關系（P＜0.01）。

圖2 Hg2+對花翅搖蚊幼蟲體組織中CAT活性的影響Fig.2 Effect of Hg2+on CAT activity in tissues of larval chironomus Chironomus kiiensis

圖3 正常（A）和汞作用下（B）花翅搖蚊幼蟲大顎（200×）Fig.3 The mandibles of normal（A）and exposed to Hg2+（B）larval chironomus Chironomus kiiensis（200×）

3 討論

3.1 Hg2+對花翅搖蚊幼蟲體組織抗氧化酶活性的影響

Hg2+是外源毒物，會使DNA、酶、功能蛋白分子等結構破壞和活性失活等[4]，如誘導超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等的活性變化，間接反映了環境中氧化應激的存在，可以作為環境污染脅迫的指標[14]。Michailova等[19]研究表明，生化標志物是搖蚊幼蟲敏感的毒性標志物，提供環境中污染物的早期預警指標。其次，重金屬可以產生活性氧，誘導氧化應激，刺激抗氧化酶參與細胞的防御機制[16]，而Hg是機體的非必需元素，不參與抗氧化應激，會引起SOD和CAT等酶的活性規律性變化。SOD和CAT可以有效地清除生物體內過多的超氧陰離子自由基，降低氧自由基對有機體的傷害[20]，減少其對細胞的過氧化傷害[21]。由此可見，SOD和CAT共同在生物體內建立了一個功能一致且相互配合的抗氧化網絡，保護機體。

在低濃度Hg2+實驗組中，Hg2+誘導機體SOD和CAT的表達和活性上升，機體內抗氧化酶的活性顯著增加，以降低活性氧自由基的損傷；隨著Hg2+濃度的升高，大量的Hg2+進入機體內，機體內自由基處于一種較高的狀態，機體內抗氧化酶活性也一直高于對照組。隨著濃度的繼續升高，機體受到重度逆境脅迫，Hg2+抑制機體的抗氧化酶活性，抗氧化酶活性逐漸降低。張清順等[21]對梨形環棱螺Bellamya purificata的研究也證實了這一點。

劉曼紅等[15]研究發現，SOD和CAT活性隨Hg2+濃度增加而逐漸升高，其濃度范圍較寬泛（0mg·L-1、0.003mg·L-1、0.009mg·L-1、0.027mg·L-1、0.081mg·L-1、0.243mg·L-1和0.729mg·L-1），不能表現出低劑量下搖蚊幼蟲抗氧化酶活性的波動，在試驗過程中投喂金魚幼魚顆粒飼料，而搖蚊幼蟲以沉積物為食，沉積物內有大量的Hg2+，如果投喂飼料，可能會降低搖蚊幼蟲對沉積物的攝入，使搖蚊體內的Hg2+含量低于直接以沉積物為食的搖蚊體內Hg2+的含量，影響到Hg2+暴露對搖蚊幼蟲的毒性效應。其次，其實驗溫度（26.0～28.0℃）比本實驗溫度（17.0±1.0）℃高。在16.0～28.0℃范圍內，溫度越高，越適合搖蚊幼蟲生長發育。而本實驗中，濃度范圍較窄（最高濃度為0.256mg·L-1），抗氧化酶活性波動更加明顯。

本文研究了Hg2+對搖蚊幼蟲生物抗氧化酶活性的影響，并未涉及神經遞質，研究內容還不夠全面，在以后的研究中應補充這一部分。

3.2 Hg2+脅迫對花翅搖蚊幼蟲口器結構的影響

在毒物的不斷刺激下生物會加強對能量的利用，產生不同的反應，使細胞的形態和功能發生改變。不同發育階段的機體，對毒物的反應不同[12]。一些有毒物質能影響水生生物捕食所需的時間，影響試圖捕捉食物所需的次數，或者影響其是否能吞咽食物[12]。生物體畸形可以作為有毒物質影響生物行為的一種表現。畸形的簡單性和快速性也使得畸形程度的評估已成為沉積物質量的生物標志物，因此研究重金屬對搖蚊幼蟲的致畸作用具有重要意義。

水生生物可重將金屬吸附在器官表面，影響器官的正常生理功能，誘發細胞畸型[4]。Hg2+對搖蚊幼蟲的致畸作用主要是口器畸型，影響搖蚊幼蟲的攝食和生長發育。許多研究已證實，重金屬如Hg2+[13]和Cu2+[14]對搖蚊幼蟲口器的致畸作用。據閆賓萍和宋志慧[13]報道，0.01mg·L-1Hg2+急性毒性作用下羽搖蚊幼蟲口器變脆，下唇板上的牙齒不對稱，中間牙齒磨損，絕大多數大顎牙齒數減少。本實驗中，未發現Hg2+對花翅搖蚊幼蟲下唇板的致畸作用，說明急性和慢性毒性試驗中Hg2+對搖蚊幼蟲的致畸部位不同。目前，重金屬致口器畸型的作用機理尚未明確，但許多研究證實，重金屬濃度及暴露時間與致畸率之間存在線性關系，因而搖蚊幼蟲的致畸率及致畸部位成為水環境評價的重要參數之一。本實驗中未觀察到搖蚊幼蟲形態結構更加細微的畸型，還有待進一步研究。

本實驗結果表明：搖蚊幼蟲對水體Hg2+污染能做出顯著的形態和生理響應，可以將搖蚊幼蟲形態特征和生理特征作為檢測水體Hg2+污染的重要生物監測指標。這為研究水體Hg2+對水生生物影響以及完善生物監測指標提供了參考。

致謝：感謝東北林業大學野生動物資源學院孫雅薇在試驗過程中給予的幫助，感謝林學院閆國永在文章修改中給予的幫助。

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Effect of Hg2+Exposure on Teratogenesis Mouthparts and Antioxidant Enzyme Activity in Larval Chironomus Chironomus kiiensis

CHEN Fei,LIU Man-hong,CAI Yan,MA Yu-kun
（College of Wildlife Resources,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China）

Chronic toxicity of mercury to larvae of chironomus Chironomus kiiensis was studied by using standard-sediment method in a laboratory.The activities of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）related to antioxidant enzymes and teratogenic mouthparts were monitored in the homogenate of tissues in the 4 instar larvae of the chironomus exposed to Hg2+concentrations of 0.002 mg· L-1,0.004 mg·L-1,0.008 mg·L-1,0.016 mg·L-1,0.032 mg·L-1,0.064 mg·L-1,0.128 mg·L-1and 0.256 mg·L-1.The results showed that Hg2+led to obvious effects on the activities of SOD and CAT,with significant concentration-response relationship（P＜0.05）．The chironomus larvae exposed to Hg2+for 30 d showed a significant positive correlation between the mandibular length in mouthparts and the exposure concentration of Hg2+（P＜0.01）.The findings indicate that the morphological structure and physiological function of chironomus larvae can be used as an important biological indicator for monitoring of water pollution of Hg2+since the low concentration of Hg2+stress has led to significantly change in morphology and physiology of chironomus larvae.

Hg2+;Chironomus kiiensis;antioxidant enzyme;terotagenesis

X835

A

1005-3832（2016）05-0055-05

2016-06-07

中央高校基本科研業務費專項資金資助（2572014EA07-03）.

陳菲（1992-），女，碩士研究生，水生生物學專業.

馬玉堃（1962-），男，博士，碩士研究生導師，從事水環境生物學研究.E-mail:mayukun66@126.com