羅非魚類立克次氏體病的組織病理學觀察

戚瑞榮，唐紹林，崔龍波，雷燕，馬家好

（1.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東 廣州 510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東 廣州 510515；3.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

羅非魚類立克次氏體病的組織病理學觀察

戚瑞榮1，2，唐紹林1，2，崔龍波3，雷燕1，2，馬家好1，2

（1.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東 廣州 510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東 廣州 510515；3.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

本文主要研究感染類立克次氏體（Rickettsia-like organism，RLO）的養殖羅非魚（Oreochromis aureus♂× Oreochromis niloticus♀）肝、脾、腎、腸、鰓和心臟的組織病理變化。感染類立克次氏體的羅非魚各器官廣布粗糙不圓整的白色小結節，這些結節為肉芽腫壞死灶，分層不典型，與周圍健康組織的界限不甚明顯；嚴重病變的組織壞死區域較大，與周圍明顯增生的細胞形成清晰的巨大“肉瘤”狀腫物。經吉姆薩-瑞氏染色后，在病變組織內，尤其是脾腎組織的巨噬細胞胞質內可見藍紫色球狀或顆粒樣、成簇分布的類立克次氏體。這些發現可為羅非魚類立克次氏體病的病理學診斷提供依據。

類立克次氏體；羅非魚；組織病理；組織印片；吉瑞染色

立克次氏體（Rickettsia）系龐大的家族，為多形性革蘭氏陰性菌，直徑0.5～1.5μm，專性細胞內寄生，在宿主組織細胞有膜結合的胞質空泡內復制[1]，人和多種動物包括魚都可感染發病，是導致國內外魚類發生嚴重傳染病的病原體類群[2]。

Mohamed等在埃及發病的河鲀Tetrodon fahaka體內首次發現類立克次氏體。自20世紀90年代以來，魚立克次氏體病及其綜合癥已經遍布多個國家和地區，感染十幾種經濟魚種，包括細鱗Brachymystax lenok tsinlingensis、大麻哈魚Oncorhynchus gorbuscha Walbaum、大鱗大麻哈魚 Oncorhynchus tshawytscha、銀鮭Oncorhynchus kisutch、大西洋鮭Salmo salar等[2-8]。鮭科魚類立克次氏體病的特征主要是腸、腎、肝和脾等器官有彌漫性的發炎和壞死，肝靠近血管的部位有獨特的彈坑狀損傷，在巨噬細胞和其他感染細胞的細胞質內可以觀察到立克次氏體[4,5]。非鮭科魚類如石斑魚Epinephelus melanostigma、羅非魚Oreochromis niloticus、藍眼清道夫Panaque suttoni、真鯛Pagrosomus major等感染類立克次氏體也出現與鮭立克次氏體（Piscirickettsia salmonis gen.nov.,sp.nov.）病相似的癥狀和病理變化[2,9-11]。臺灣石斑魚感染類立克次氏體后，內臟組織器官充血，血管可見血栓性損傷、壞死，有結節，感染的組織細胞有大空泡[11]。電鏡觀察臺灣患病的羅非魚細胞中桑葚狀包涵體內有魚類立克次氏體[12]。真鯛類立克次氏體引起魚前腸、中腸和后腸的嚴重水腫及空腸狀態，腸上皮細胞的細胞質和微絨毛中有大量類立克次氏體樣原核生物及其在發生基質內存在“裝配”增殖現象[13]。

本文通過觀察云南患病羅非魚肝、脾、腎、腸、鰓、心的組織切片發現，羅非魚組織中的白色結節是由類立克次氏體引起，進而研究羅非魚感染類立克次氏體后各器官的組織病理變化，為該病的臨床診斷提供組織病理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

感染發病的羅非魚采自云南省寧河縣當地羅非魚養殖場，現場觀察記錄感染魚的臨床及解剖學特征。

1.2 組織切片的制備

取病變器官肝、脾、腎、腸、鰓、心的組織塊，固定于Bouin's液中，常規脫水、透明、石蠟包埋，切片（厚度5μm），蘇木精-伊紅（H&E）染色，光鏡觀察。

1.3 組織印片的制備及染色

取病變器官組織，用解剖刀將組織切割出一個整齊的切面，將此切面平行印在載玻片上（輕觸一下載玻片即可），待組織印面稍干后，用甲醇固定1min，晾干，4℃保存備用。

對組織印片染色時，先用吉姆薩染液染色15～20min，然后不經水洗直接滴加瑞氏染液染色1min，水洗、晾干，樹膠封片后（也可不封片直接鏡檢）于光學顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 感染類立克次氏體的羅非魚的癥狀及解剖學特征

2010年冬季首次在云南發現養殖羅非魚出現病癥，之后每年10月～翌年5月中旬低溫期（水溫17～25℃）均發病。感染類立克次氏體的羅非魚在水中上浮、靠邊，中午和下午會上來“停尸”（即停在水面一動不動，有人靠近時或會游走），死亡前常常打轉。羅非魚內臟組織尤其是脾、腎組織可見白色結節，呈嚴重的“肉瘤”狀（圖1）。

2.2 感染類立克次氏體的羅非魚內臟組織病理變化

切片觀察發現：感染類立克次氏體的羅非魚肝、脾、腎、心組織中均出現肉芽腫結節性壞死灶，這些壞死灶長橢圓形、邊界不圓整、分層不典型，常多個大小不一的壞死灶融合在一起；壞死灶與周圍組織界限不清；肝組織中可見少量肉芽腫壞死灶，肝細胞固縮、有崩解（圖2-1、圖2-2）；脾組織中可見大量的肉芽腫壞死灶，淤血，脾實質組織細胞崩解、消失（圖2-3、圖2-4）；腎組織中有大量肉芽腫壞死灶，腎固有組織細胞崩解、消失（圖2-5、圖2-6）；腸腔內有少量食物及少量脫落壞死細胞，腸上皮近腔端有壞死；鰓輕微淤血，鰓小片上皮腫脹，細胞脫落、壞死、溶解，形成許多溶解性的空腔，鰓小片間輕微細胞增生；心肌中可見個別肉芽腫，心肌纖維壞死（圖2-7、圖2-8）。綜合發病羅非魚的剖檢特征和組織病變特征，最具病理診斷意義的特征是：各器官普遍出現白色小結節，結節粗糙、不圓整；這些結節的顯微結構為肉芽腫壞死灶，與周圍健康組織的界限不甚明顯，分層不典型；嚴重病變的組織、壞死區域和周圍明顯的細胞增生形成清晰的大“肉瘤”狀腫物。

圖1 羅非魚患類立克次氏體病時內臟組織的外觀特征Fig.1 Visceral tissue characteristics in tilapia diseased by rickettsia-like organism（RLO）

2.3 感染類立克次氏體的羅非魚內臟組織印片染色結果

發病羅非魚內臟組織印片經吉瑞染色后，在脾、腎的巨噬細胞胞質內觀察到藍紫色、球狀或顆粒樣、成簇的菌體（圖3），初步確定為類立克次氏體。

圖2 患類立克次氏體病的羅非魚組織病變特征Fig.2 Histopathological characteristics in tilapia diseased by RLO

圖3 患類立克次氏體病的羅非魚組織印片Fig.3 The tissue imprints stained with Giemsa-Wright in tilapia diseased by RLO

3 討論

無論是鮭科魚類，還是非鮭科魚類，感染類立克次氏體后的病理解剖學特征和最具病理診斷意義的特征都是內臟出現白色結節[4,5,9,11]。感染類立克次氏體的羅非魚肝、脾、腎等組織，尤其是脾腎組織，均有大量乳白色或灰白色的結節，嚴重的呈巨大“肉瘤”狀腫物。這些乳白色或灰白色的“肉瘤”樣大結節，在光鏡下為大小不一融合在一起的多個肉芽腫。肉芽腫普遍存在，但在各組織中的數量及其中心壞死區的大小等有差異。感染RLO的羅非魚的病變特征為組織細胞嚴重變性、壞死及存在大量的慢性肉芽腫炎癥，與其他魚類和合浦珠母貝Pinctada fucata的病變相似[4,5,9,11,14]。郭瓊林等[15]在感染RLO的烏鱧Ophiocephalus argus的肝、脾、腎等組織中也觀察到類似的肉芽腫。但病變較嚴重的羅非魚組織中，較大的組織壞死區域和周圍明顯的炎性增生形成邊界清楚可見的類似“腫瘤”樣的團塊，即本文中病檢時觀察到的巨大“肉瘤”狀腫物。

檢測魚立克次氏體的“金標準”是用易感魚類的細胞系進行細菌分離培養[16]，但檢測條件比較苛刻，現場很難進行無菌操作，且魚立克次氏體對低濃度抗生素敏感，不適合現場檢測。有研究人員利用血瓊脂培養基成功分離培養出鮭立克次氏體[17]，但培養基營養要求高，現在還沒有標準的培養方法。目前一般用組織印片或者涂片的吉姆薩染色、革蘭氏染色等判定類立克次氏體。本實驗發現，吉姆薩-瑞氏染色后比較容易觀察到組織印片中的類立克次氏體。

羅非魚類立克次氏體形成的結節與單純諾卡氏菌感染引起的分層明顯的典型結節不同[18]：前者外觀不圓整、連成一片；組織切片光鏡下觀察，結節分層不典型，與周圍健康組織分界不明顯，常多個大小不一的結節性壞死灶融合在一起。

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Histopathological Observation of Disease of Rickettsia-like Organism in Tilapia（Oreochromis niloticus）

QI Rui-rong1,2,TANG Shao-lin1,2,CUI Long-bo3,LEI Yan1,2,MA Jia-hao1,2
（1.Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co.Ltd.,Guangzhou 510515,China; 2.Guangzhou Jinshui Animal Health Products Co.Ltd.,Guangzhou 510515,China; 3.College of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China）

The histopathological changes in liver,spleen,kidney,intestine,gill and heart were described in tilapia（Oreochromis aureus♂×Oreochromis niloticus♀）infected by rickettsia-like organism（RLO）.The tilapia infected by RLO is most pathologically and anatomically characterized by rich in rough small white nodules without round in shape in diagnosis.The microscopic observation revealed that the nodules are the atypically stratified granuloma in structure without obvious boundaries between the necrosis tissues and healthy tissues.It appears that the nodules are obviously a huge“sarcoma”due to the large and obvious cell proliferation in the tissue of severe lesions.The RLO are bluish violet,spherical or particles and clustered,and observed in the lesion in tissue imprint stained by Giemsa-Wright,especially in the macrophages of spleen and kidney.The findings can provide evidence for pathologic diagnosis of the disease of rickettsia-like organism in tilapia.

rickettsia-like organism;tilapia;histopathology;tissue imprint;Giemsa-Wright staining

S941.42+9

A

1005-3832（2016）03-0021-04

2016-03-05

國家科技支撐計劃項目（2012BAD17B01）.

戚瑞榮（1986-），女，碩士研究生，從事水產動物疾病研究.E-mail:qrr1177@163.com