α-硫辛酸對半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡的保護作用

榮季冬 姜順濤 鄧玉潔 劉會 張曙影 石蓓

α-硫辛酸對半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡的保護作用

榮季冬1姜順濤1鄧玉潔1劉會2張曙影3石蓓1

目的探討以同型半胱氨酸（Hcy）預處理血管內皮細胞的損傷作用及不同劑量α-硫辛酸（ALA）對其保護作用。方法將HUVEC-12細胞株進行人工傳代培養，并隨機分為三組，空白對照組、Hcy組（0.2 mmol/L）、ALA組（0.2 mmol/L Hcy+0.5 mmol/L ALA）。干預24 h后應用MTT法觀察其對內皮細胞存活的影響、激光顯微鏡直接觀察其對對內皮細胞內活性氧的影響。結果細胞經Hcy處理后，細胞明顯受抑制，且Hcy能誘導內皮細胞產生氧自由基（ROS），而ALA可拮抗Hcy的氧化應激作用，差異具統計學意義（P＜0.01）。結論Hcy可通過增加細胞胞內ROS生成引起內皮細胞氧化損傷，而α-硫辛酸可通過抑制氧化應激保護受損內皮細胞。

血管內皮細胞；高半胱氨酸；α-硫辛酸

血管內皮細胞是一種多功能細胞，它不僅是血管壁組織和血液之間的第一道通透性屏障，而且還是人體最大的自分泌﹑旁分泌及內分泌器官，能夠合成和分泌多種生物活性物質。炎癥及氧化應激均可引起血管內皮細胞損傷，導致動脈粥樣硬化（AS）和血栓形成。半胱氨酸（Hcy）是動脈粥樣硬化性心血管疾病的獨立危險因素，可參與損傷血管內皮細胞并導致形成[1]。α-硫辛酸是一種抗氧化劑，由于其低廉的價格以及良好的抗氧化作用已被廣泛應用于臨床。臨床實驗表明α-硫辛酸在改善人體體質﹑抗氧化﹑促進糖代謝﹑減輕糖尿病并發癥﹑缺血再灌注引起的腦神經損害等方面都有很好的預防及緩解作用[2]。然而，α-硫辛酸是否可通過調節LOX表達參與保護內皮細胞，目前國內外尚無文獻報道。本實驗設計通過半胱氨酸建立血管內皮細胞損傷模型，并以α-硫辛酸進行干預，觀察α-硫辛酸是否對半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡有保護作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

臍靜脈內皮細胞株（HUVEC-12）購于中南大學湘雅醫院中心實驗室；同型半胱氨酸﹑DMSO﹑MTT試劑盒購于Sigma公司；0.25%胰酶-0.03 EDTA細胞消化液購于Gibco公司；1640培養基購于Hyclone公司。將HUVEC-12細胞株進行人工傳代培養，并隨機分為三組，空白對照組﹑Hcy組（0.2 mmol/L）﹑ALA組（0.2 mmol/L Hcy+0.5 mmol/L ALA）。

1.2 實驗方法

（1）內皮細胞系的培養：臍靜脈內皮細胞株（HUVEC-12）購于中南大學湘雅醫院中心實驗室，以1 640培養基作為細胞培養液，且培基中含10%FCS﹑100 U/ml青霉素及0.1 g/L鏈霉素。后以1×105/ml密度接種于75 ml培養瓶中，加培養液10 ml，于37℃，5%CO2飽和濕度條件下靜置培養。以含0.25%胰蛋白酶-0.03%EDTA的消化液進行消化傳代。

（2）α-硫辛酸對內皮細胞存活的影響：將生長狀態良好的第2～5代HUVEC-12傳代24 h后消化，加入含0.2 mmol/L的Hcy，再加入濃度為0.5 mmol/L ALA，孵育20 h后再加入MTT溶液，繼續孵育4 h后用酶標儀在490 nm波長下測定各孔的吸光度。

（3）α-硫辛酸對內皮細胞膜上活性氧的影響：將生長狀態良好的第2～5代HUVEC-12傳代24 h后消化，6 h后觀察細胞貼壁情況，加入濃度為0.2 mmol/L的Hcy預處理細胞2 h，再加入濃度為0.5 mmol/L的ALA共同孵育22 h。37℃細胞培養箱內孵育20 min后用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 細胞培養

所培養的HUVEC呈典型卵石形或多角形，見圖1。

圖1 HUVEC-12細胞

2.2 α-硫辛酸對半胱氨酸刺激后細胞存活的影響

Hcy組數值低于空白對照組（P＜0.01），ALA組光吸收值與Hcy組比較明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 ALA對Hcy刺激HUVEC-12后細胞存活的影響（OD值，±s，n=3）

表1 ALA對Hcy刺激HUVEC-12后細胞存活的影響（OD值，±s，n=3）

注：＊P＜0.01 vs. Hcy組；＊＊P＜0.01 vs. 空白對照組

組別 光吸收值空白對照組 0.906±0.080 3＊Hcy組 0.251 6±0.029 9＊＊ALA組 0.595 9±0.028 3＊F 213.781

2.3 α-硫辛酸對內皮細胞產生活性氧的影響

與空白對照組相比，Hcy（0.2 mmol/L）組致內皮細胞產生ROS則更為顯著（P＜0.01）。ALA組雖較空白對照組ROS產生無減少（P＜0.05），但與Hcy組相比ROS產生減少（P＜0.05），說明ALA能明顯抑制Hcy所致的內皮細胞ROS生成，見圖2，圖3。

圖2 ALA對Hcy（0.2 mmol/L）誘導內皮損傷后產生氧自由基的影響

圖3 不同藥物對內皮細胞產生氧自由基的影響

3 討論

血管內皮細胞不僅是血液和血管床之間的屏障，起到促進水及小分子的交換作用。同時也是一個內分泌器官，通過產生分泌一系列血管活性物質，對血管舒縮功能的調節﹑凝血及抗凝血，炎癥反應的誘導等方面都具有重要的作用[3]。

高Hcy血癥是血管內皮細胞損傷的危險因素，實驗研究顯示[4]，血Hcy升高可損傷內皮細胞并導致脂質過氧化，產生的氧自由基可能參與AS過程。有研究表明[5]，氧化應激在冠心病中明顯加強，而且游離MDA在不穩定型和穩定型心絞痛患者間有明顯差別。ALA作為一種“萬能抗氧化劑”，不僅可參與保護內皮細胞，使其免受自由基和過氧化物的損傷[6]。新近有研究指出，ALA可改善早期糖尿病腎病患者氧化應激和血管內皮功能[7]。在孟馨等[8]的報道中，ALA還可參與抑制血管內皮細胞凋亡。我們推斷通過應用ALA也可達到改善內皮功能障礙的作用，且其機制除了抑制活性氧產物增加外有關。

本次實驗表明，Hcy對內皮細胞的存活具有抑制作用，在應用中等濃度Hcy損傷內皮細胞后，ALA組光吸收值較Hcy組升高（P ＜0.01）。結果表明在ALA作用下，內皮細胞的活性均可增加，且還可拮抗Hcy對內皮細胞的損害而發揮保護作用。

由于ALA可提高抗氧化應激的能力，清除過氧化脂質。本研究表明，Hcy能夠使細胞膜上ROS釋放增加，在其濃度為0.05～0.4 mmol/L呈劑量依賴。應用ALA后內皮細胞活性氧釋放明顯較Hcy組減少（P＜0.05）。可見ALA可增強細胞的抗氧化能力，以此對抗Hcy對內皮細胞的損傷作用。

[1]鄧宇鯤，閆冰，陳濤，等. 血漿同型半胱氨酸水平與頸動脈斑塊相關性的研究[J]. 中國循環雜志，2014，29（5）：363-366.

[2]王瑩，王恩，王鳳，等，α-硫辛酸對兔動脈粥樣硬化斑塊形成的影響[J]. 心腦血管病防治，2016，16（3）：178-180.

[3]王全偉，凡文博，王智昊，等，氧化應激與心血管疾病關系的研究進展[J]. 中國老年學雜志，2014，34（1）：192-194.

[4]Hemanth KB，Arun RR，Mahesh KJ，et al. Effects of fisetin on hyperhomocysteinemia-induced experimental endothelial dysfunction and vascular dementia[J]. Can J Physiol Pharmacol，2016，8（11）：1-11.

[5]陳燕銘，吳琳，劉勇，等. 通心絡對同型半胱氨酸損傷的內皮細胞的基因表達譜的影響[J].中國病理生理雜志，2011，27（1）：42-47.

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[7]姚偉峰，黃雌友，吳衛國，等. α-硫辛酸對早期糖尿病腎病患者氧化應激和血管內皮功能的影響[J].中國老年學雜志，2014，34（2）：359-360.

[8]孟馨，王滌非，伊桐凝，等. α-硫辛酸對糖基化終產物誘導血管內皮細胞凋亡的影響[J].中國老年學雜志，2010，30（21）：3104-3105.

The Protective Role of α-Lipoic Acid in the Homocysteine Induced Apoptosis of Vascular Endothelial Cells

RONG Jidong1JIANG Shuntao1DENG Yujie1LIU Hui2ZHANG Shuying3SHI Bei11 Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563000, China, 2 Department of Cardiology, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang Guizhou 550000, China, 3 Department of Cardiology, The Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian Liaoning 116000, China

ObjectiveTo investigate the protective effect of different doses of alpha lipoic acid (ALA) on vascular endothelial cells pretreated with homocysteine (Hcy).MethodsHUVEC-12 cell lines were cultured in vitro, and randomly divided into three groups: blank control group, Hcy group (0.2 mmol/L), ALA group (0.2 mmol/L Hcy+0.5 mmol/L). after 24 hours, observe the effect of MTT on the survival of endothelial cells, and laser irradiation on the activity of reactive oxygen species in endothelial cells.ResultsAfter treated with Hcy, the cells were significantly inhibited, and Hcy could induce the production of oxygen free radicals (ROS) in endothelial cells, while ALA could antagonize the oxidative stress of Hcy, and the difference was statistically significant (P＜0.01).ConclusionHcy can protect endothelial cells from oxidative damage by increasing intracellular ROS production, while alpha lipoic acid can protect endothelial cells from oxidative stress.

Endothelial dysfunction, Hyperhomocysteinaemia, α-lipoic acid

R913

A

1674-9308（2016）34-0139-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.34.077

貴州省科學技術基金資助（編號：黔科合J字LKZ[2012]24號）

1遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州 遵義563000；2貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽 550000；3大連大學附屬中山醫院心內科，遼寧 大連 116000

張曙影，E-mail：rongjidong@163.com