DNA甲基化與動脈粥樣硬化的研究進展

李嬌嬌，楊茹

連云港市第一人民醫院，江蘇連云港222000

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DNA甲基化與動脈粥樣硬化的研究進展

李嬌嬌，楊茹

連云港市第一人民醫院，江蘇連云港222000

研究表明表觀遺傳學改變參與了動脈粥樣硬化的發病機制。其中DNA甲基化研究最為廣泛。該綜述主要關注參與動脈粥樣硬化過程的基因，包括與內皮功能紊亂有關的一氧化氮合成酶、雌激素受體、XV型膠原α1和10-11易位蛋白；受高膽固醇和同型半胱氨酸水平調節的p66shc、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1及載脂蛋白E；與動脈炎癥反應有關的干擾素γ、叉頭框p3及腫瘤壞死因子-α。

DNA甲基化；動脈粥樣硬化；表觀遺傳學

動脈粥樣硬化是一種血管壁脂肪聚集導致的慢性炎癥反應。很多證據提示表觀遺傳學改變參與了動脈粥樣硬化斑塊的發生發展及其相關疾病的發病過程。調節基因沉默與激活的主要表觀遺傳機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及RNA機制。其中DNA甲基化研究最為廣泛。DNA甲基化一般是通過DNA甲基轉移酶（DNMTs）導致化學穩定的表觀遺傳學修飾并抑制基因的表達。該綜述主要關注動脈粥樣硬化過程中發生表觀遺傳學修飾的基因，包括與內皮功能紊亂有關的一氧化氮合成酶（NOS）、雌激素受體（ERs）、XV型膠原α1（COL15A1）和10-11易位（TET）蛋白；受高膽固醇和同型半胱氨酸（Hcy）水平調節的p66shc、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX1）及載脂蛋白E（APOE）；與動脈炎癥反應有關的干擾素γ（IFN-γ）、叉頭框p3（FOXP3）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。

1　內皮功能紊亂與DNA甲基化

在動脈粥樣硬化過程中，表觀遺傳機制可發生在正常動脈壁含量最豐富的內皮細胞和血管平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMC）。正常情況下它們處于靜止狀態，細胞增殖和基質合成率低。當血管損傷時，SMC表現出顯著的表型可塑性，并通過遷移、增殖、合成基質、凋亡、炎癥、攝取膽固醇等方面促進動脈粥樣斑塊的形成。研究發現主要的心血管危險因素，如糖尿病、高血壓和血脂異常等都可影響SMC表型，也提示了SMC在動脈粥樣硬化發展中的作用。許多研究提示SMC中發生廣泛的表觀遺傳學改變。使用影響血管細胞表觀遺傳途徑的藥物有可能成為治療血管疾病的新途徑。

內皮的eNOS（endothelial NOS，eNOS）由NOS3基因編碼，它是內皮基因受染色質可接近性調控的最好例子。NOS3啟動子區的染色質結構在內皮細胞處于轉錄容許狀態，而在非內皮細胞則為抑制狀態。生理狀態下，內皮細胞中NOS3啟動子區發生低甲基化。而在非表達的細胞型如SMC中，則發生DNA高甲基化。動脈粥樣硬化斑塊中內皮細胞NOS3的信使RNA（messenger RNA，mRNA）被下調。但在包括SMC在內的大多數晚期斑塊組織中，NOS3與編碼誘導型NOS（inducibleNOS，iNOS）的NOS2，編碼神經型NOS（neuronal NOS，nNOS）的NOS1的mRNA均被上調。因此DNA甲基化在特定細胞中調控NOS的正確轉錄方面起著非常重要的作用。藥物抑制試驗也證實了NOS3啟動子功能的重要性。用一種DNMT抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，DAC）處理SMC后，發現NOS3的mRNA水平被上調。另外，最近一項評估兒童NOS1 DNA甲基化的增加與頸動脈內膜中層厚度之間關系的研究表明，NOS1 DNA甲基化通過調節NO的產生，有可能成為動脈粥樣硬化的生物標志物。

DNA甲基化還影響表征血管老化和動脈粥樣硬化的ERs表達。事實上ERα和ERβ被認為是人動脈保護基因，調節雌激素對內皮細胞和SMC的保護作用。ERα的缺乏導致男性動脈粥樣硬化的加速進展。離體的人冠狀動脈粥樣硬化組織和升主動脈斑塊區域中衰老的內皮細胞和SMC的ERα和ERβ均發生高甲基化。主動脈SMC中編碼COL15A1蛋白的基因表達亦受DNA甲基化的影響。COL15A1啟動子區呈低甲基化，則其轉錄和蛋白表達水平增高，促進人主動脈粥樣硬化的發展。SMC和內皮細胞中也表達編碼組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2），又稱胎盤蛋白的基因。它與細胞外基質有關，抑制多種參與凝血、纖溶和細胞外基質降解等機制的絲氨酸蛋白酶。約30%的動脈粥樣硬化斑塊中TFPI-2基因發生高甲基化，并伴隨mRNA水平的顯著降低。相反，作為對照的正常乳腺動脈中TFPI-2則呈高表達。因此，TFPI-2基因甲基化過程可能與斑塊的穩定性有關。

最近的一項研究表明TET蛋白在DNA去甲基化方面發揮重要的調節作用。TET蛋白家族通過使相關基因的5-甲基胞嘧啶轉化為5-羥甲基胞嘧啶，從而誘導DNA去甲基化并激活基因轉錄。TET2通過直接調節靶基因，如心肌素（MYOCD）、血清反應因子（SRF）和肌球蛋白-11（MYH11）的染色質可接近性來誘導SMC分化。這些表觀遺傳變化對在體及離體的SMC表型產生影響，增加了SMC的可塑性。從輕、中、重度動脈粥樣硬化患者的冠狀動脈活檢中發現，TET2的過表達與MYOCD蛋白水平的增加有關。而TET2敲減則可抑制MYOCD和SRF的表達，從而防止SMC轉化成收縮表型、血管損傷及動脈粥樣硬化的發生。

近期的一項全基因組DNA甲基化分析研究，比較了動脈粥樣硬化斑塊病變組織與相應的無斑塊組織以確定與動脈粥樣硬化有關的低甲基化和高甲基化基因。果蠅headcase（HECA）、早期B細胞因子1（EBF1）和核苷酸結合寡聚化結構域2（NOD2）基因發生低甲基化。而人絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）、鋅指E盒結合同源框1（ZEB1）及FYN基因則發生高甲基化。進一步提示DNA甲基化參與了動脈粥樣硬化的發病機制［1］。

2　高膽固醇、高Hcy水平與DNA甲基化

外周血白細胞全基因組DNA甲基化分析是一種很好的評估動脈粥樣硬化風險的生物標志。2002年Hiltunen MO的研究團隊第一次從載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠和氣囊裸露模型的新西蘭大白兔動脈粥樣硬化損傷處，檢測到基因組5-甲基胞嘧啶含量顯著下降。隨后檢測到ApoE-/-小鼠外周血單核細胞與主動脈全基因組DNA均呈低甲基化［2］。

p66shc是高膽固醇血癥導致基因表觀遺傳修飾的一個典型例子。它在高膽固醇血癥小鼠中介導內皮氧化應激和脂質條紋形成。低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL）膽固醇使內皮細胞p66shc啟動子發生低甲基化，從而促進內皮功能紊亂。另外一個受影響的基因是參與血管內皮穩態的轉錄因子Kruppel樣因子2（Kruppel-like factor 2，KLF2）。LDL通過DNA甲基化減少人內皮細胞KLF2的表達，下調它的靶基因，如血栓調節蛋白、eNOS和纖溶酶原激活物抑制劑1。此外，LDL膽固醇可以使血管保護基因如凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1（lectin-like oxLDL receptor，LOX1）的啟動子區發生高甲基化。OxLDL誘導LOX1啟動子高甲基化，并抑制其表達。OxLDL通過DNA甲基化對血管內皮細胞進行表觀遺傳修飾并導致晚期斑塊的凋亡抵抗。

在家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia，HF）病人中，低密度脂蛋白受體（The low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因通過調節LDL顆粒的內吞在膽固醇穩態方面起重要作用。LDLR基因甲基化異常參與了動脈粥樣硬化的發生發展。Guay SP等［3］在患有早期動脈粥樣硬化的FH患者中證實了基因多態性，他們發現在膽固醇酯轉移蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）和脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）啟動子基因位點存在個體間表觀基因差異，并且與血脂質譜變異性有關。此外，在動脈粥樣硬化患者外周血中發現LDLR和卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶基因啟動子區的DNA甲基化水平存在變異性。新的基因多態性如ABCG1、LIPC和PLTP的DNA甲基化與FH患者的HDL-C、LDL-C、甘油三酯水平有關，并促進了血漿脂質水平的變異性。主要的脂蛋白代謝基因的表觀遺傳學改變與血漿脂質水平有關，導致個體間差異。這至少部分解釋了FH患者中血漿脂質水平的遺傳性缺失現象。

1999年紐曼研究團隊猜測異常的DNA甲基化可能控制動脈粥樣硬化進程，并猜測其與Hcy含量增加有關［4］。血Hcy水平增高是動脈粥樣硬化的獨立危險因素。HHcy可導致NO、VEGF和Akt生成減少，血管發生中斷，SMC增殖，血脂異常，血管氧化應激和內皮損傷。HHcy還誘導一些基因特異性啟動子甲基化，并改變其調節的基因表達。在人內皮細胞中，Hcy通過抑制DNMT1、DNA低甲基化和組蛋白乙酰化誘導細胞周期蛋白A基因沉默和生長抑制。HHcy在冠心病患者中誘導全基因組DNA高甲基化，但在晚期動脈粥樣硬化的人、兔、鼠血管組織和外周血細胞中則發生全基因組DNA低甲基化。另外有研究表明，循環Hcy水平與動脈粥樣硬化中DNA甲基缺失呈顯著相關性。以上這些研究提示DNA甲基譜的改變可能成為動脈粥樣硬化的早期標志，并可能在動脈粥樣硬化發生中起致病作用。

另外，有研究提示Hcy可誘導白細胞端粒靜止和縮短。在動脈粥樣硬化患者中白細胞端粒長度（leukocytetelomere length，LTL）縮短，加速了內皮細胞或祖細胞的衰老。一項流行病學研究也報道了血清Hcy水平的增高與人LTL縮短相關。在HHcy動脈粥樣硬化患者和小鼠模型中的研究提示，hTERT啟動子DNA去甲基化可能成為Hcy誘導的動脈粥樣硬化的表觀遺傳調控的靶基因。研究者發現高血Hcy水平能誘導DNA去甲基化并下調hTERT從而導致LTL縮短。這一研究發現了Hcy介導的端粒酶失活的新機制，獨立于已知的通過NADPH氧化酶介導的NO水平降低并增加氧化應激。

3　在冠心病患者中，二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2

（dimethylargininedimethylaminohydrolase2，DDAH2）啟動子高甲基化可能與內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）功能紊亂有關。Hcy可通過DDAH2啟動子高甲基化損害EPC粘附功能，而這種作用可被Aza（DNMT抑制劑）預處理所逆轉。這些結果也印證了DNA甲基化在動脈粥樣硬化進展中的作用。

近期，人動脈粥樣硬化DNA甲基化地圖的繪制已可用于鑒定參與動脈粥樣硬化的發生及內皮和SMC功能的異常甲基化CpG。在動脈粥樣硬化病變處觀察到的DNA甲基化增加，使應用DNA去甲基化藥物治療動脈粥樣硬化成為可能。

4　動脈粥樣硬化炎癥反應與DNA甲基化

眾所周知，動脈粥樣硬化是血管慢性炎癥反應性疾病。單核細胞衍生的巨噬細胞與特異性T細胞決定了動脈粥樣硬化相關的免疫反應［5］。在動脈粥樣硬化小鼠模型中已證實促炎細胞因子在動脈粥樣硬化的發展中起關鍵作用。事實上，編碼促炎細胞因子（如IL-12、IFN-γ、IFN-γ受體、TNF-α）的基因缺失可減少這些基因敲除鼠的動脈粥樣硬化發生。

在動脈粥樣硬化斑塊中存在幾個從同一幼稚前體T細胞衍生的T細胞亞型，主要是CD4+T細胞和一些CD8+T細胞。迄今為止，在體和離體實驗表明表觀遺傳調控發生在CD4+T細胞分化成Th1、Th2或者血管保護的調節T細胞表型的過程中。在人動脈粥樣硬化斑塊早期主要存在產生IFN-γ的Th1-T細胞。Th2-T細胞通常被認為是抗動脈粥樣硬化的。調節T細胞（Treg）則控制Th1/Th2的平衡。參與動脈粥樣硬化過程的炎癥因子如IFN-γ、PDGF和ICAM-1基因的表達可能受DNA甲基化調控［6-7］。Th1細胞中IFN-γ位點通過DNA甲基化重塑可調控IFN-γ的表達。研究發現在DNMT敲除小鼠和應用DNMT抑制劑的T細胞中IFN-γ的表達增加。

DNA甲基化調控也發生在FOXP3啟動子區。FOXP3是Treg細胞中控制CD4+-Th1/Th2分化的主要轉錄因子。Treg細胞與非Treg CD4+細胞相比，FOXP3啟動子呈現不同的甲基化水平。從急性冠脈綜合征患者中分離出的外周血單個核細胞，用OxLDL處理后，DNA甲基化程度增加。體外研究表明OxLDL通過上調DNMT活性使DNA高甲基化從而抑制FOXP3的表達。因此，Treg細胞可能在人急性冠脈綜合征中發揮重要的保護作用，下調Treg細胞將增加動脈粥樣硬化的風險。

血單核細胞趨化蛋白1（Blood monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）在炎癥反應及動脈粥樣硬化早期形成階段發揮重要作用。HHcy可誘導MCP-1介導的動脈粥樣硬化炎癥反應。一些研究提示在HHcy影響下，MCP-1啟動子DNA低甲基化可能通過NF-κB/DNMT1信號途徑誘導動脈粥樣硬化斑塊形成［8］。離體實驗通過使用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸酯證實了這種作用。NF-κB抑制劑處理使NF-κB水平下調而DNMT1含量提高。

5　結論和展望

許多研究支持表觀遺傳改變參與了早期動脈粥樣硬化的發病機制。涉及參與動脈粥樣硬化過程不同階段的基因，尤其是參與內皮功能紊亂、炎癥反應及受高膽固醇和Hcy水平調節的基因。其中DNA甲基化研究最為廣泛。然而目前大部分數據來自體外研究或者有關動脈粥樣硬化形成的在體模型研究。仍然缺乏臨床試驗數據的支持。DNA甲基化的改變是可逆的，這就為基于DNA甲基化的治療提供了樂觀的前景。深入的研究DNA甲基化將有利于對動脈粥樣硬化發病機制的認識和治療措施的改進。

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Research Progress of DNA Methylation and Atherosclerosis

LI Jiao-jiao，YANG Ru
Lianyungang First People's Hospital，Lianyungang，Jiangsu Province，222000 China

The research shows that the genetics change is involved in the pathogenesis of atherosclerosis，and the DNA methylation research is most wide，the paper mainly discusses the genes involved in the atherosclerosis process，including nitric oxide synthetase，estrogen receptor，type XV collagen α1 and 10-11 translin related to the endothelial disfunction，p66shc adjusted by hypercholesterolemia and coronary heart disease level，lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 and apolipoprotein E，interferon γ，forkhead box p3 and tumor necrosis factor-α related to the artery inflammatory reaction.

DNA methylation；Atherosclerosis；Epigenetics

R543.5

A

1672-5654（2016）09（a）-0186-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.25.186

2016-06-10）

李嬌嬌（1987-），女，江蘇東海人，博士研究生，住院醫師，研究方向：腦血管病。