殼寡糖對仿刺參體腔液細胞免疫的影響

盧亞楠，王 武，李 明，張建清，王 麗，叢玉婷

大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連，116023

殼寡糖對仿刺參體腔液細胞免疫的影響

盧亞楠，王 武，李 明，張建清，王 麗，叢玉婷

大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連，116023

考察了三種抗凝劑對仿刺參體腔細胞的抗凝效果，研究了殼寡糖作為免疫添加劑對仿刺參體腔液細胞吞噬能力的影響，利用化學發光法檢測殼寡糖對吞噬過程中活性氧作用的影響。結果發現，無菌海水對刺參體腔細胞具有一定的抗凝效果，且細胞形態和活性保持較好，將殼寡糖以1%、3%的質量濃度添加入到基礎飼料中，分別檢測體腔液細胞吞噬情況和呼吸氧爆發情況，結果表明殼寡糖可顯著提高仿刺參體腔液細胞吞噬能力和活性氧水平(P<0.05)，總體表現為1%殼寡糖組>3%殼寡糖組>對照組。

仿刺參；殼寡糖；體腔液細胞；吞噬；活性氧

仿刺參(Apostichopusjaponicus)為我國北方棘皮動物養殖的重要經濟種類[1-2]。近年來，隨著集約化養殖業的迅猛發展，養殖海參的水體環境逐漸惡化，海參疾病頻繁發生，給養殖專業戶帶來了嚴重的經濟損失[3-4]。為了減少海參疾病造成的損失，養殖專業戶大量使用抗生素和化學藥物，雖然取得了一定的效果，但污染了水體環境，動物及其產品殘留有藥物，影響人體健康，因此國家對這類藥物的使用已作了嚴格限制[5]。為了解決海參養殖中病害與食品安全等問題，一些學者著手免疫增強劑的研究，即在海參飼料中添加免疫增強劑如多糖、寡糖、益生菌等，以提高海參機體的免疫機能，進而減少病害的發生。

殼寡糖作為免疫增強劑，在魚蝦和海參的養殖上已有相關研究[6-7]，但對殼寡糖提高海參免疫力的機理和效果鮮有報道。為此，本文研究殼寡糖對仿刺參體腔液細胞吞噬作用和吞噬過程中呼吸氧爆發現象的影響，并探究殼寡糖作為免疫添加劑提高仿刺參體腔液細胞免疫功能的機理和效果，以期為海參的綠色養殖和疾病防治提供可靠的理論依據。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與飼料1.1.1 材 料

仿刺參購于遼寧省普蘭店某水產養殖有限公司，大小為25～30 g左右，于(50×35×20)cm PVC水槽內暫養3天，投喂基礎飼料(購于大連海洋大學海珍苗種培育基地，為幼參配合飼料)，至仿刺參出現有規律攝食為止。

1.1.2 飼 料

實驗用殼寡糖購自大連化學物理研究所。將殼寡糖粉劑分別以0%(對照組)、1%、3%的濃度加到海參基礎飼料中，混勻后，置于陰涼、干燥的地方，密封、備用。

1.2 儀器與試劑1.2.1 儀 器

化學發光儀(Centro XS3 LB960型，德國Berthold Technologies公司)，顯微鏡(Olympus CX21型，日本奧林巴斯有限公司)，高速離心機(GT10-1型，上海化工機械廠有限公司)，真空抽濾器(C-50型，北京眾益眾和生物技術有限公司)。

1.2.2 試 劑

無菌海水：海水取自大連海洋大學海養樓，用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾并高壓滅菌。

酵母懸液：取5 mg干酵母，用少量離心仿刺參體腔液自體血清調理2 h以上(室溫)，再用無菌海水20 mL配成2 mg/mL的懸液，分裝于聚乙烯離心管冰凍貯存，用前融化。

魯米諾溶液(3-氨基鄰苯二甲酰肼)：取0.78 g氫氧化鉀、0.618 g硼酸和0.014 g魯米諾粉劑，溶解于10 mL的雙蒸水中，然后移置棕色瓶中，放入冰箱(4℃)貯存[8]。

殼寡糖：用無菌海水配置200 μg/mL寡糖溶液，4℃下貯存備用。

1.3 方 法1.3.1 仿刺參培養

實驗分為A、B和C三組，A組為基礎飼料組，不加殼寡糖；B組添加1%的殼寡糖；C組添加3%的殼寡糖。每組設2個平行，每個平行隨機放入25頭25～30 g仿刺參，試驗中水溫設為(14±2)℃，pH為8±0.12，鹽度30。每天投喂飼料一次，定時換水，每次換水約為總水量的三分之一,連續充氣。

實驗每5天取樣一次。使用0.5 mL無菌注射器吸取酵母懸液0.5 mL(用無菌過濾海水配制成4 mg/mL),分別從仿刺參背部注射入體腔，每次每組取2頭仿刺參，3 h后解剖、收集體腔液。

1.3.2 體腔液細胞抗凝劑的篩選

選用0.01 mol/L EGTA溶液、1.0 mg/L EDTA-Na2和無菌海水作為體腔液細胞抗凝劑，并分別將它們與體腔液細胞按1∶1的比例混合，顯微鏡下觀察在不同的時間內體腔液細胞形態和細胞群落凝集情況。

1.3.3 吞噬率測定

將所取體腔液與無菌海水按1∶1比例均勻混合，顯微鏡下觀察并記錄體腔液細胞吞噬情況。

1.3.4 活性氧測定

從A、B和C三組仿刺參體內各取150 μL體腔液細胞，分別加入發光板孔內，使用Centro XS3LB960化學發光儀測定體腔液的基礎發光值，然后加入150 μL魯米諾溶液，記錄發光最高值，考察不同濃度對仿刺參體腔液細胞吞噬過程中呼吸氧爆發的影響。

表1 三種抗凝劑對仿刺參體腔細胞的抗凝效果

注:+++為凝集情況嚴重.TIF，++為凝集較嚴重.TIF，+為凝集較輕，-為基本無凝集；P++++為伸展狀況好，變形細胞變形明顯，無細胞破裂現象；P+++為伸展狀況較好，變形細胞偽足伸出明顯減少，無明顯的細胞破裂現象；P++為伸展情況差，大部分變形細胞縮回偽足，細胞出現輕微破裂現象；P+為變形細胞幾乎無偽足伸出，并且細胞出現較嚴重的破裂現象，體腔液內有細胞破裂物存在。

2 結 果

2.1 體腔液細胞抗凝劑的確定

根據表1，綜合細胞形態和細胞群落凝集情況，無菌海水對刺參體腔細胞具有一定的抗凝效果，且細胞形態和活性保持完好，伸展狀況好，變形細胞變形明顯，無細胞破裂現象，因此選定作為無菌海水仿刺參體腔液細胞抗凝劑。

2.2 飼喂殼寡糖對仿刺參體腔液細胞吞噬率的影響

由圖1可知，隨投喂時間的延長，不同濃度的殼寡糖對仿刺參體腔液細胞吞噬的影響趨勢不同。培養5 d，A組和C組的差異不明顯；培養10 d后，B組顯著高于A組和C組(P<0.05)。

圖1 殼寡糖對仿刺參體腔液細胞吞噬的影響

2.3 飼喂殼寡糖對仿刺參體腔液細胞吞噬過程中呼吸氧爆發的影響

由圖2可知，各組仿刺參體腔液細胞吞噬過程中呼吸氧爆發均隨時間延長呈現出不同的趨勢。10天后，B組呼吸氧爆發活性變化明顯，且均顯著高于A組和C組(P<0.05)。

圖2 殼寡糖對仿刺參體腔液細胞吞噬過程中呼吸氧爆發的影響

4 結 論

從以上實驗結果可知，殼寡糖對仿刺參非特異性免疫能力產生了影響，且濃度不同作用效果不同，一般隨著殼寡糖濃度的升高，作用有一個由低到高，再由高到低的變化，但高濃度未見有抑制作用。具體來說，投喂殼寡糖對仿刺參吞噬情況和呼吸氧活性有顯著增強效應，雖在不同個體體腔液中作用時間和作用效果有些差異，但均能表現出免疫指標的增強，對仿刺參體腔液中吞噬情況和呼吸氧活性的影響幾乎都在15天左右達到最高，且殼寡糖添加質量百分比為1%比較合適。

[1]Yang H,Yuan X,Zhou Y．et a1．Effects of body size and water temperature on food consumption and growth in the sea cucumber Apostichopus japonicas (Selenka) with special reference to aestivation[J].Aquac Res,2005,36:1085-1092

[2]陳效儒,張文兵,麥康森.飼料中添加甘草酸對刺參生長、免疫及抗病力的影響[J].水生生物學報,2010,34(4):731-738

[3]Zhang C Y,Wang Y G,Rong X J.Isolation and identification of causative pathogen for skin ulcerative syndrome in Apostichopus japonicas[J].J Fisheries Chin,2006,30(1):118-123

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[8]Scott L k,Klesius P H.Chemiluminescence:A novel analysis of phagocytosis in fish[J].Dev Biol Stand,1981,49:243-254

(責任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.12.025

2016-08-12

遼寧省教育廳一般計劃項目(L2013278)。

盧亞楠(1977-),女,遼寧營口人,博士,實驗師,主要研究方向:水產動物醫學。

R734.2

A

1673-2006(2016)12-0086-03