燈盞花素對肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1，Smad3表達的影響

鐘秀宏 , 張以忠 , 孫艷美 , 楊寧江 , 齊 玲 , 趙東海 ,鄭中華 , 趙麗微 , 王 爽 , 溫 娜 ， 楊淑艷

(吉林醫藥學院 , 吉林吉林132013)

燈盞花素對肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1，Smad3表達的影響

鐘秀宏 , 張以忠 , 孫艷美 , 楊寧江 , 齊 玲 , 趙東海 ,鄭中華 , 趙麗微 , 王 爽 , 溫 娜 ， 楊淑艷

(吉林醫藥學院 , 吉林吉林132013)

為了觀察燈盞花素對肝纖維化大鼠肝組織中 TGF-β1和Smad3表達的影響, 探討燈盞花素抗大鼠肝纖維化的作用機制， 方法：將大鼠32只隨機分為對照組、 模型組、 水飛薊賓組和燈盞花素組， 采用皮下注射四氯化碳(CCl4)造成大鼠肝纖維化模型， 每周兩次， 連續 8 周。 留取肝左葉行 H.E.Masson染色, 免疫組化方法檢測各組TGF-β1和Smad3的表達， 然后光鏡下觀察肝組織學變化和TGF-β1和Smad3表達量。結果與對照組比較， 模型組TGF-β1和Smad3的表達明顯增強(P<0.05)，和模型組比較， 燈盞花素可顯著減少TGF-β1和Smad3的表達(P<0.05), 而且肝纖維化減輕。 表明燈盞花素可抑制大鼠肝纖維化模型中TGF-β1和Smad3的表達, 從而發揮抗肝纖維化作用。

燈盞花素 ; 肝纖維化 ; 肝星狀細胞 ; Smad3； TGF-β1

前期我們研究發現燈盞花素可以抑制肝內纖維組織形成，并明顯降低肝組織羥(基)脯氨酸含量、 MDA含量及升高 SOD 活力，推斷抗氧化損傷可能是燈盞花素抗肝纖維化作用機制之一[1]。近年來大量研究顯示[2-3]，肝纖維化是以細胞外基質(ECM)在肝臟內沉積為特征,且肝星狀細胞(HSC)活化在肝纖維化中發揮關鍵作用。因此,抑制HSC激活以及ECM的沉積是一個非常重要的抗肝纖維化的靶點。目前研究發現，許多藥物通過干預TGF-β/Smad信號轉導通路來抑制HSC激活以及ECM的沉積[4]，因此，本次研究擬通過建立CCl4誘導大鼠肝纖維化模型, 觀察燈盞花素對 TGF-β1/Smad 信號轉導通路的影響, 旨在進一步探討其抗肝纖維化的作用機制,以為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 燈盞花素片(昆明興中制藥有限責任公司)；水飛薊賓膠囊(天津天士力制藥股份有限公司)；使用時用生理鹽水溶解，配制相應濃度；四氯化碳(CCl4，天津市大茂化學試劑廠)；試驗前用滅菌精制花生油配成 40% 濃度；CCl4(分析純，西安化學試劑廠，批號：090106)；SABC 盒、DAB顯色試劑盒和 兔抗大鼠Smad3、TGF-β1多克隆抗體均購自武漢博士德生物制品有限公司；ZMN-7803 型全自動組織包埋機(常州市華利電子有限公司)；RM2126 型輪轉式切片機(上海徠卡儀器有限公司)；BA300 型數碼生物顯微鏡(中國麥克奧迪實業集團有限公司) 。

1.2 實驗動物 健康 Wistar 大鼠(吉林大學實驗動物中心)，32只，雌雄各半，體重200±20g。清潔級，許可證號:SCXK(吉)2008-0005。環境溫度為(23±1)℃，相對濕度為40%。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 將大鼠適應喂養1周后，隨機分為：對照組，模型組，水飛薊賓組，燈盞花素組，每組8只。對照組給予生理鹽水，其余3組建立肝纖維化模型。

1.3.2 造模及給藥 除對照組外，其余3組大鼠背部皮下注射40% CCl41.5 mL/kg，每周兩次，首次劑量加倍，造成肝纖維化模型。對照組給予等體積的生理鹽水。其余5 d 水飛薊賓和燈盞花素組分別以水飛薊賓 150 mg/kg和燈盞花素 80 mg/kg灌胃，對照組和模型組分別以生理鹽水灌胃，各組灌胃體積相同，連續8周，第8周末處死大鼠。

1.3.3 標本制作 取肝臟左葉，于10%中性緩沖福爾馬林液中固定，固定的肝臟組織包埋制作蠟塊, 常規切片,厚度為4 μm。

1.3.4 肝臟病理形態學觀察 組織切片H.E.常規和Masson染色。肝纖維化程度分期標準[5]：0級：正常肝臟，未見肝纖維化；Ⅰ級：包括匯管區、匯管區周圍纖維化和限局竇周纖維化或小葉內纖維瘢痕，二者均不影響小葉結構的完整性；Ⅱ級：可見纖維間隔即橋接纖維化，雖有纖維間隔形成，但是小葉結構大部分保留；Ⅲ級：大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，致小葉結構紊亂，但是尚無肝硬化；Ⅳ級：早期肝硬化，肝實質廣泛破壞，彌漫性纖維增生，被分隔的肝細胞團呈不同程度的再生及假小葉形成。

1.3.5 肝臟免疫組織化學檢測 組織切片經過常規脫蠟脫水, 3% H2O2室溫孵育10 min,以去除內源性過氧化物酶, 蒸餾水洗, 將切片于 0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液中微波煮沸修復10 min, 馬血清封閉非特異性抗原, 分別滴加兔抗大鼠多克隆抗體TGF-β1(1∶100)、Smad3(1∶200) 50 μL, 以 PBS緩沖液代替 Ⅰ抗作為陰性對照, 4 ℃冰箱過夜, PBS洗 3 min×3次, 滴加生物素化羊抗兔抗體IgG, 辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液進行反應, 用新鮮配置的 DAB顯色, 顯微鏡下控制反應時間, 終止反應, 蒸餾水洗, 蘇木素復染, 鹽酸乙醇分化, 脫水,透明, 中性樹膠封片, 光鏡下觀察TGF-β1、smad3表達情況。

免疫組化結果：根據細胞染色程度及染色細胞百分率進行分析評定[6]:基本不著色者為0分,著色淡黃者為1分, 棕黃者為2分, 棕褐者為3分; 著色細胞占計數細胞百分率: 5%以下為0分, 6%～25%為1分, 26%～50%為 2分, >51%為3分。將每張切片染色程度與染色細胞百分率得分各自相乘,為其最后得分。0 分為(- ),1～3分為 (+),4～6 分為(++),7～9 分為(+++)。

2 結果

2.1 肝組織病理學觀察 對照組大鼠肝小葉結構完整，無纖維組織增生(見中插彩版圖1A)；模型組大鼠肝組織中肝索排列紊亂, 可見肝細胞點狀壞死, 伴少量炎性細胞浸潤, 肝細胞空泡變性散在分布, 間質增生明顯, 膠原纖維構成的纖維間隔形成, 其破壞界板, 分割、包繞肝小葉, 形成較為完整的假小葉(見中插彩版圖1B)；燈盞花素組和水飛薊賓組大鼠肝組織肝小葉多呈放射狀分布, 膠原纖維間隔較少, 肝細胞壞死、 炎性細胞浸潤少見, 匯管區結締組織增生不明顯(見中插彩版圖1C、D)。

各組大鼠肝纖維化分級比較,模型組肝纖維化分級顯著重于正常組( 與正常組比較,P<0.05 ), 燈盞花素組和水飛薊賓組可以顯著減輕模型大鼠肝纖維化(與模型組比較, 均P<0.05 ), 燈盞花素組和水飛薊賓組兩兩比較差異無顯著性意義(P>0.05 )見表1。

表1 各組大鼠肝組織肝纖維化程度比較

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05，下表同

2.2 TGF-β1和smad3免疫組化結果

2.2.1 TGF-β1免疫組化結果 TGF-β1主要在細胞漿內，其次是細胞膜。正常組大鼠肝組織在正常肝細胞內幾乎無表達,肝竇間隙、匯管區基質及間質細胞胞質內有少量表達。模型組肝內TGF-β1表達明顯增強,主要見于小葉周圍擴大的纖維組織內的成纖維細胞、竇周細胞、炎性細胞以及增生的膽小管周圍梭狀細胞內,肝細胞內無表達。TGF-β1表達的陽性強度明顯高于正常組(P<0.05)；燈盞花素組和水飛薊賓組大鼠陽性染色程度較模型組明顯減輕,主要表達集中在匯管區、間質細胞和炎性細胞胞質內。燈盞花素和水飛薊賓可以顯著減少肝纖維化大鼠TGF-β1的陽性表達, 燈盞花素組和水飛薊賓組與模型組比較差異有顯著性意義(均P<0.05)。大鼠肝組織TGF-β1陽性表達結果比較見表2；免疫組化結果見中插彩版圖2。

表2 大鼠肝組織TGF-β1陽性表達結果比較

2.2.2 Smad3免疫組化結果 正常對照組肝組織幾乎無表達, 僅在匯管區基質及間質細胞胞漿內極微量表達。模型組Smad3 表達明顯增強,陽性細胞數目明顯增多。Smad3主要分布于纖維間隔、匯管區、門靜脈、中央靜脈、肝小葉周圍和竇壁周圍的非實質細胞,以纖維間隔為主。經統計學分析,Smad3表達的陽性強度明顯高于正常組(P<0.05);燈盞花素組和水飛薊賓組Smad3在肝組織內的表達量減少, 陽性表達集中在匯管區和門靜脈、中央靜脈周圍。燈盞花素和水飛薊賓可以顯著減少肝纖維化大鼠Smad3的陽性表達,與模型組比較差異有顯著性意義(均P<0.05)。 各組大鼠肝組織Smad3陽性表達結果比較見表3；免疫組化結果見中插彩版圖3。

表3 大鼠肝組織Smad3陽性表達結果比較

3 討論

肝纖維化(hepatic fibrosis)是多種慢性肝臟疾病發展為肝硬化的中間環節，是由于細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的合成和降解失衡造成的以ECM沉積為特點的疾病。在這一病理過程中，細胞與細胞因子及基質之間相互作用，使肝臟細胞外基質代謝紊亂，在竇周間隙過度沉積，繼之肝竇毛細血管纖維化，造成在肝臟內沉積過多，最后導致肝纖維化。

近年來隨著對TGF-β/Smad信號傳導系統研究的加深, TGF-β/Smad在器官纖維化中的作用逐漸引起了人們的重視。TGF-β1 與 HSC 膜 Tβ2R 受體(TGF-β2receptor，Tβ2R)結合，并磷酸化 Tβ1R，活化的Tβ1R 再磷酸化激活 Smad(1，2，3，5，8)某一成員，其中磷酸化的Smad2，Smad3 能誘導 Tβ1R/Smad 復合物形成[7]，致使HSC 活化為成肌纖維細胞(myofibroblasts，MFB)，MFB進一步受到刺激，可合成和分泌大量ECM，并抑制其降解，而HSC 又以自分泌和旁分泌方式，上調 TGF-β1的表達，加速肝纖維化的進展[8]。因此，以 TGF-β/Smad 通路為靶點的抗肝纖維化治療，已成為藥物開發的一個新熱點[9]。本試驗免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組肝纖維化大鼠肝組織中 TGF-β1、Smad3陽性表達明顯，而與模型組比較，給予燈盞花素后，肝臟組織中內源性 Smad3和TGF-β1表達減少，形態學觀察肝損傷和肝纖維化程度也減輕。上述提示，燈盞花素可通過抑制內源性 Smad3蛋白表達，減弱了肝星狀細胞內TGF-β1/Smad 信號轉導，阻止膠原蛋白等ECM合成來發揮其抗肝纖維化作用。

[1] 楊淑艷，鐘秀宏，趙麗微，等. 燈盞花素對大鼠肝纖維化保護作用[J].中國公共衛生，2011，27(11)：1460-1461.

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[3] 劉志勇，易堅，鄒小明．蓮子心萃取物抑制大鼠肝纖維化的作用機制研究[J]. 中國臨床藥理學雜志，2015,31(17)：1749-1753.

[4] 尚立芝，王付，王琦，等.柴胡疏肝散對肝纖維化大鼠 TGF-β1/Smad 信號通路的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2015,21(12)：125-128.

[5] 衛生部.病毒性肝炎病理組織學診斷標準[J].中華病理學雜志，1996,24(2)：122.

[6] 賁長恩, 李叔庚.組織化學[M].北京: 人民衛生出版社, 2001: 663.

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2015-12-18

吉林市科技發展計劃項目(201032242)

鐘秀宏(1971-)，女，副教授，碩士，主要從事中藥肝損傷防護研究,E-mail：xhzhong0611@163.com

楊淑艷,E-mail:xhzhong0611@163.com

R587.1

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0529-6005(2016)12-0105-03