副豬嗜血桿菌同一質粒攜帶blaROB-1和aacA-aphD耐藥基因

楊守深 ， 孫 堅 ， 范克偉 ， 楊小燕 ， 廖曉萍

(1.龍巖學院生命科學學院， 福建 龍巖 364012； 2. 福建省家畜疫病防治與生物技術重點實驗室， 福建 龍巖 364012； 3. 華南農業大學獸醫學院， 廣東 廣州 510642)

副豬嗜血桿菌同一質粒攜帶blaROB-1和aacA-aphD耐藥基因

楊守深1,2， 孫 堅3， 范克偉1,2， 楊小燕1,2， 廖曉萍3

(1.龍巖學院生命科學學院， 福建 龍巖 364012； 2. 福建省家畜疫病防治與生物技術重點實驗室， 福建 龍巖 364012； 3. 華南農業大學獸醫學院， 廣東 廣州 510642)

探討1株副豬嗜血桿菌攜帶介導β-內酰胺類藥物耐藥基因blaROB-1耐藥質粒的基因環境。抽提陽性菌的耐藥質粒，采用電轉法將耐藥質粒轉入DH5α，運用Southern blot確定耐藥基因blaROB-1的位置，通過測序獲得耐藥質粒的基因組成結構。結果表明，該菌攜帶有2個質粒，其中1個質粒(pQY431-1)攜帶有耐藥基因blaROB-1，該質粒成功轉入受體菌DH5α，轉化子較受體菌對阿莫西林、頭孢克洛、慶大霉素、卡那霉素以及阿米卡星的MIC分別提高了64倍、16倍、 32倍、64倍和2倍。該質粒全長為7 777 bp，其基因環境由潛在的移動和復制區、一個截斷的ISApl1插入序列、耐藥基因aacA-aphD和blaROB-1組成。

副豬嗜血桿菌；抗菌藥；耐藥基因；基因環境

副豬嗜血桿菌 (Haemophilusparasuis, HPS) 屬于革蘭陰性菌，主要引起豬多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎, 又稱格拉瑟病 (Gl?sser′s disease)。獸醫臨床上，β-內酰胺類抗生素常被用于治療該病。本課題組對華南地區臨床分離的145株副豬嗜血桿菌進行藥物敏感性分析，并對β-內酰胺類藥物耐藥基因檢測時，發現其中1株菌QY431攜帶有blaROB-1耐藥基因，對部分β-內酰胺類藥物產生耐藥，如青霉素、頭孢克洛，但是對頭孢噻呋(<0.064 μg/mL) 和頭孢噻肟(<0.064 μg/mL) 高度敏感；該菌還對氨基糖苷類藥物慶大霉素產生耐藥。因此，本文擬對該菌耐藥基因環境進行研究，分析耐藥基因的組成結構及其傳播機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TSA和TSB，購自OXOID公司；MH瓊脂和LB瓊脂，購自廣東環凱微生物科技有限公司；血清，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，添加量為5%。輔酶I，購自Omiga公司，配置濃度為2 μg/mL。質粒 DNA 提取試劑盒，購自德國QIAGEN公司；Southern雜交試劑盒，購自美國Roche 公司；ExTaq聚合酶，購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR引物合成由深圳華大基因科技服務有限公司完成。

1.2 耐藥質粒的提取和Southern雜交 質粒DNA提取和Southern雜交均按照試劑盒使用說明書進行操作。

1.3 電轉及轉化子鑒定 取2.5～5 μL質粒DNA加入到DH5α感受態細胞，進行脈沖(2.5 kV)電擊后，取100 μL涂布于含有10 μg/mL頭孢克洛的LB瓊脂上。挑取生長的單菌落進行PCR檢測是否含有blaROB-1基因(blaROB-1-F：5′-TGTTGCAATCGCTGCC-3′，blaROB-1-R：5′-TTATCGTACACTTTCCA-3′)鑒定其是否為陽性轉化子。

1.4 藥物敏感性分析 藥敏試驗的測定參考NCCLS(2002)推薦方法，采用96孔酶標板二倍稀釋法測定各菌株的MIC值，耐藥折點參考文獻報道[1]。大腸桿菌DH5α和轉化子藥物敏感性測定按照CLSI推薦方法(2010)。藥敏試驗以胸膜肺炎放線菌 ATCC 27090和大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌。

1.5 質粒測序 抽提轉化子質粒DNA，并測序，將結果通過DNAStar軟件中的EditSeq進行序列拼接，然后提交NCBI。

2 結果

2.1 耐藥質粒抽提及基因定位 成功抽提菌株QY431的質粒，該菌含有兩個質粒，分別是 ～7 kb和 ～6 kb，命名為pQY431-1和pQY431-2；通過電擊轉化的方法，質粒pQY431-1成功轉入E.coliDH5α感受態細胞，并抽提轉化子質粒DNA，原菌及轉化子質粒電泳圖見圖1中的 I。運用地高辛標記blaROB-1探針，通過Southern雜交技術，確定blaROB-1位于 ～7 kb的質粒上，見圖1中的II。

圖1 質粒電泳及Southern雜交圖

注：M：V517；I：1，QY431質粒圖，2，轉化子質粒圖；II：1 QY431質粒雜交條帶，2，轉化子質粒雜交條帶

2.2 轉化子的MIC結果 轉化子的藥物敏感性試驗結果見表1。轉化子與受體菌相比阿莫西林、頭孢克洛、慶大霉素、卡那霉素以及阿米卡星的MIC分別提高了64倍，16倍，32倍，64倍和2倍。其中轉化子對阿米卡星的MIC升高不明顯，僅從0.25 μg/mL上升到0.5 μg/mL，對鏈霉素的MIC不變。

表1 QY431、轉化子和受體菌的MIC比較

注：副豬嗜血桿菌對頭孢克洛、青霉素和慶大霉素耐藥折點分別是 ≥ 8 μg/mL，≥ 4 μg/mL和 ≥ 16 μg/mL

2.3 質粒序列分析 pQY431-1完全測序，全長為7 777 bp (KC405065)，由潛在的移動和復制區、一個截斷的ISApl1插入序列、耐藥基因aacA-aphD和blaROB-1組成，見圖2。從圖中還可得出pQY431-1與pFS39 (KC405064) 相比，除耐藥區中aacA-aphD不同外，其余組成部分相同。

圖2 質粒pQY431-1與質粒pFS39、pB1002和pB1000的基因環境比較

質粒pQY431-1中ISApl1序列與pB1002相比在其內部缺失了659 bp，然而，他們的3′ 和 5′ 端都完整保留見圖2。通過序列分析發現，在ISApl1內部有2個片段序列分別是TCGTTC和TCGTTTC，他們僅差一個堿基T，巧合的是在ISApl1截斷部分正好是這兩段序列中間的區域和其中一段的TCGTTTC，見圖3。

圖3 質粒pQY431-1截斷IS Apl1的基因環境

3 討論

由于抗菌藥長期不規范使用，細菌產生耐藥性，常常造成獸醫臨床治療失敗。目前在副豬嗜血桿菌中僅發現兩種可介導β-內酰胺類藥物耐藥的基因，分別是blaTEM型和blaROB-1[2]。其中，耐藥基因blaROB-1不僅介導青霉素，阿莫西林，氨芐西林耐藥，還可介導第二代頭孢克洛耐藥[3]；但是該耐藥基因對第三代頭孢菌素，如頭孢噻呋和頭孢噻肟高度敏感。本試驗曾以工程菌J53、C600作為受體菌，研究質粒pQY431-1的可轉移性。雖然不斷通過優化共培養的條件，但是最終都未能獲得結合子。Gonzalez-Zorn等在研究質粒 pB1000時，同樣以大腸桿菌作為受體菌，也未能獲得結合子[4]。這可能有很多因素影響結合試驗，雖然副豬嗜血桿菌和大腸桿菌都屬于陰性桿菌，但是他們自身的生物學特性都差別很大。

序列分析發現，質粒pQY431-1與pFJS5863 (HQ015159) 的同源率高達99%；與pFS39擁有相似的結構，它們還與質粒pHN61 含有相同的移動和復制區[5]。以上質粒可能從一個相同或相近的耐藥質粒，經過演變而來。細菌產生鈍化酶是對氨基糖苷類藥物耐藥的重要耐藥機制之一，其中aacA-aphD基因編碼的修飾酶可引起慶大霉素、卡那霉素交叉耐藥，過度表達時還可對阿米卡星耐藥[6]。在本試驗中，轉化子對慶大霉素和卡那霉素的MIC較受體菌有明顯提高，但是對阿米卡星的MIC與受體菌相比僅從0.25 μg/mL增加到0.5 μg/mL。插入序列ISApl1 在胸膜肺炎放線菌AP76首次確認并命名[7]，在質粒pQY431-1中，插入序列ISApl1內部缺失了659 bp，但兩端仍舊保留，該現象同樣在質粒pFS39中發生。ISApl1對blaROB-1的移動可能扮演著重要角色，ISApl1功能有待于進一步深入研究。

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Co-location of the bla ROB-1 gene and aacA - aphD gene on a small plasmid in Haemophilus parasuis

YANG Shou-shen1,2, SUN Jian3, FAN Ke-wei1,2, YANG Xiao-yan1,2, LIAO Xiao-ping3

(1.College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364012, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory for the Prevention and Control of Animal Infectious Diseases and Biotechnology, Longyan 364012, China; 3. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China )

The purpose of this article was to analyze the genetic environment of theblaROB-1gene in oneHaemophilusparasuisstrain，which conferring resistance to β-lactam antibiotics. Plasmid DNA was extracted and introduced into anE.coliDH5α by electroporation. TheblaROB-1gene was shown by Southern blot hybridization. The plasmid was sequenced to analyze the genetic environment of the resistance gene. The results showed that the strain carryied two plasmids. One plasmid (pQY431-1) was successfully introduced into a DH5α recipient. The transformant showed 64-, 16-, 32-, 64- and 2-fold increases in the MICs of amoxicillin, cefaclor, gentamicin, kanamycin and amikacin, respectively, when compared with the recipient strain. It was 7777 bp long, consisting of the potential mobilization and replication region, a truncated ISApl1 and the resistance genesblaROB-1andaacA-aphD.

Haemophilusparasuis; antibiotics; resistance gene; genetic environment

LIAO Xiao-ping

2016-05-18

廣東省自然科學基金(S2012030006590)

楊守深(1982—)，男，講師，博士，主要從事獸醫藥理學研究，E-mail ：31526230@qq.com

廖曉萍，E-mail：xpliao@scau.edu.cn

S852.61

A

0529-6005(2016)12-0075-03