不同宿主來源犬瘟熱病毒H基因的克隆測序與分析

史一珺， 宋曉明， 于忠偉， 張洪亮， 焦緒娜， 黃 娟， 單 虎

(1.青島農業大學 山東省預防獸醫學重點實驗室， 山東青島266109；2.乳山市午極鎮畜牧獸醫工作站，山東乳山264503；3.煙臺市飼料監察所， 山東煙臺264008)

不同宿主來源犬瘟熱病毒H基因的克隆測序與分析

史一珺1， 宋曉明2， 于忠偉3， 張洪亮1， 焦緒娜1， 黃 娟1， 單 虎1

(1.青島農業大學 山東省預防獸醫學重點實驗室， 山東青島266109；2.乳山市午極鎮畜牧獸醫工作站，山東乳山264503；3.煙臺市飼料監察所， 山東煙臺264008)

應用RT-PCR的方法從2013-2015年來自我國部分地區20份犬、貂、狐和貉源犬瘟熱陽性病料中克隆得到犬瘟熱病毒(CDV)H基因。序列分析結果表明，20株CDV的H基因核苷酸與推導氨基酸序列的同源性分別為:90.6%～100%和90.5%～100%；相應地，與CDV3、Onderstepoort等傳統疫苗株相比，其同源性分為90.4%～99.9%和89.0%～99.8%。基于CDV H基因推導氨基酸序列構建系統進化樹的結果顯示，除TS1510屬于Amecica-1型外，其余全部為Asia-1型。表明Asia-1型犬瘟熱病毒仍為目前一些地區流行基因型，弱毒感染動物也可使之產生典型犬瘟熱癥狀。

犬瘟熱病毒； H基因； 同源性比較； 進化樹分析

犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CaninedistemperVirus，CDV)引起的一種發病急、傳播速度快，可導致犬、狐、貉和貂等多種食肉目動物發病，且接觸性極高的傳染病[1-2]。CDV易與其他細菌、病毒以混合感染或繼發感染的方式危害動物，致死率最高可達80%。CDV對不同宿主動物的跨種屬感染，是2016年來許多研究者關注的重點[3-5]。

CDV基因組主要編碼N、P、F、M、H、L六個蛋白，其中H基因表達的血凝素蛋白會影響病毒與SLAM受體的識別與結合，且H蛋白的基因、抗原變化頻率最高，被認為是導致CDV不斷變異的重要因素，常用來評估CDV的變異情況[6-8]。本試驗以實驗室收集的出現典型犬瘟熱癥狀的患病動物病料為模板，對得到的H基因進行分析，來探究一些地區近年來CDV毒株之間H基因遺傳特征差異及病毒在宿主中進化的規律。

1 材料與方法

1.1 病料 臨床樣品取自山東、河北一些地區毛皮動物養殖場及動物醫院送檢的臨床癥狀明顯的犬瘟熱陽性病例。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒，購自Bioflux公司；PrimeScriptTMcDNA Synthesis Kit、ExTaqDNA聚合酶、 pMD18-T載體、DH5α細胞、限制性內切酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收、質粒提取試劑盒，均購自Omega公司；其余試劑為國產分析純。1.3 病毒RNA的提取、反轉錄及H基因的克隆 用RNA提取試劑盒提取犬瘟熱陽性病料中的病毒RNA，用特異性引物(序列：CDV-H-F 5’-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3’，CDV-H-R 5’-AATGCTAGAGATGGTTTAATT-3’)反轉錄合成病毒cDNA。反轉錄體系：RNA 10.5 μL，5xRT Buffer 4 μL，dNTP(10mmol/L)2 μL，CDV-H-F (10 pmol/μL)1 μL，CDV-H-R(10 pmol/μL)1 μL，M-MLV(10 U/μL)1 μL， RRI(40 U/μL)0.5 μL，42 ℃水浴1 h后70 ℃ 15 min。以cDNA作為模板參照文獻[3]中方法進行PCR擴增。用膠回收試劑盒回收純化PCR產物后克隆至pMD18-T載體。各樣品選取最少3個酶切鑒定正確的陽性克隆，送至北京華大基因科技服務有限公司測序，結果與GenBank上已公開的CDV H基因序列的ORF進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 H基因的克隆與酶切鑒定 將得到的H基因的PCR產物進行切膠回收，并克隆至pMD18-T 載體，用BamHⅠ和HindⅢ對陽性質粒pMD18-T-H進行雙酶切。結果如圖1，得到的兩條帶(分別2 690 bp和1 921 bp左右)與預期值相符。測序結果表明，各樣品H基因被成功克隆至pMD18-T載體中。

圖1 重組質粒pMD18-T-H酶切鑒定結果

M：DL-5 000； 1-2：pMD18-T-H雙酶切后； 3：質粒對照

2.2 H基因同源性分析 序列分析顯示，20個CDV H基因的ORF均為1 824 bp，其核苷酸與推導氨基酸序列的同源性分別為90.6%～100%(CY1505與LS1507、WD1303與WD1304、LL1308與ZC1302 CDV H基因的核苷酸序列完全相同)和90.5%～100%，相應地，與CDV3、Onderstepoort等傳統疫苗株相比，它們的同源性為90.4%～99.9%和89.0%～99.8%。其中TS1510與America-1型毒株核苷酸和推導氨基酸序列同源性較高，分別為97.0%～99.9%和95.1%～99.8%。

2.3 H基因推導的氨基酸的序列分析 將測得的20個CDV H基因推導的氨基酸序列與國內部分流行株、疫苗株進行比對，結果顯示，其中LL1309、RC1508、WD1309、ZC1306、WD1508 H基因推導氨基酸均存在10處潛在N-糖基化位點，分別位在第19，149，309，391，422，456，542，584，587位和603位，與SD(13)7相同。TS1510毒株有7個潛在N-糖基化位點，與CDV3株相同，是首次發現H基因有7個潛在N-糖基化位點的貉源CDV。

2.4 CDV H基因的遺傳進化分析 將測得的20個H基因序列和國內外CDV毒株核苷酸序列構建系統進化樹，如圖2，其中19個在同一個分支上，屬于Asia-1型且親緣關系較近；而TS1510屬于America-1型，與其他19株遺傳關系較遠。

圖2 基于CDV H基因核苷酸序列構建的系統進化發生樹

(▲：本文所測得的CDV H基因)

3 討論

如圖2可見，CDV可分為Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4[8]、America-2、Europe-1、Europe-2、Arctic和America-1(Vaccine)9個基因型[10]。CDV基因型的差異與病毒的分布直接相關，且其毒力會隨糖基化位點數的減少而減弱[11]。本文測得來自山東19份病料中的CDV H基因序列均為Asia-1型，可判斷為野毒感染動物而發生嚴重犬瘟熱；來自河北的TS1510為America-1型，是首次發現的弱毒感染致貉子發病的犬瘟熱病例。CDV與SLAM受體結合的重要區域包含H蛋白第542～544位的氨基酸[12]，它的突變會影響病毒入侵細胞、致病性與抗原蛋白表達水平；本文所測得序列中有5份樣品的H基因序列存在10個潛在N-糖基化位點，增加的位點正處于第542～544位，這或許導致CDV H蛋白的中和表位改變，使病毒對疫苗株誘導的中和抗體的中和作用產生逃避，從而使疫苗免疫失敗。

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Genetic analysis of haemagglutinin gene of canine distemper virus from Different hosts

SHI Yi-jun1, SONG Xiao-ming2, YU Zhong-wei3, ZHANG Hong-liang1, JIAO Xu-na1, HUANG Juan1, SHAN Hu1

(1.Shandong Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109,China; 2.Animal Husbandry and Veterinary Station of WUJi town,Rushan 264503, China; 3.Inspectorate of feed,Yantai 264008,China)

Twenty field CDV strains were collected from infected dog, mink, fox, and raccoon dog in different places of China in 2013～2015. The H genes were cloned and sequenced. Sequence analysis showed that the similarity of the measured CDV H gene nucleotides and deduced amino acid sequences were as follows: 90.6% to 100% and 90.5% to 100%, corresponding with CDV3. When compared with onderstepoort strains , the similarity for nucleotides and deduced amino acid sequence was 90.4% to 99.9% and 89.0% to 99.8%. Phylogenetic analysis showed that these strains belonged to Asia-1 genotype except TS1510, which belonged to Amecica-1 type. Our findings indicates that Asia-1 type CDV is still the prevalent genotype in some place.

canine distemper virus; H gene; homology; phylogenetic analysis

s:SHAN Hu; HUANG Juan

2016-01-18

史一珺(1989-)，女，碩士，從事動物傳染病防治及生物制品學的研究，E-mail：xifan_1989@sina.com

單虎，E-mail：shanhu67@163.com；黃娟，E-mail：happyhj888@163.com

S852.65+9.5

A

0529-6005(2016)12-0031-03