死亡相關蛋白激酶1在膀胱癌中的表達及發病機制

謝劍云 陳偉東 楊曉莉

(福建省中醫藥大學附屬人民醫院泌尿外科，福建 福州 350004)

死亡相關蛋白激酶1在膀胱癌中的表達及發病機制

謝劍云 陳偉東 楊曉莉1

(福建省中醫藥大學附屬人民醫院泌尿外科，福建 福州 350004)

目的探討死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)在膀胱癌中的表達及發病機制。方法 選取86例膀胱癌患者，提取膀胱癌組織和癌旁正常組織總RNA以及蛋白，采用RT-PCR法以及Western印跡法測定2組患者DAPK1 mRNA 以及蛋白在膀胱癌及癌旁組織中的表達。結果 86例膀胱癌組織標本中DAPK1陽性表達率為27.91%(24/86)，顯著低于癌旁組織的67.44%(58/86)(χ2=26.94，P<0.05)。膀胱癌組織標本中DAPK1 mRNA陽性表達相對灰度值明顯低于癌旁組織標本(t=21.33，P<0.05)，膀胱癌組織標本中DAPK1蛋白表達顯著低于癌旁組織標本(t=17.99，P<0.05)。TNM分期為Ⅰ～Ⅱ級者DAPK1 mRNA表達率顯著高于Ⅲ級(P<0.01)，無淋巴結轉移者DAPK1 mRNA表達率顯著高于有淋巴結轉移(P<0.01)。癌組織DAPK1 mRNA表達與患者的年齡、性別以及腫瘤部位、大小無關(P>0.05)。結論 DAPK1在膀胱癌組織標本中較癌旁組織表達低，推測其與抑制膀胱癌表達以及轉移相關。

DAPK1；膀胱癌；發病機制

膀胱癌(CUB)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，病理類型包括膀胱尿路上皮癌、鱗狀細胞癌以及腺癌等〔1〕。早期患者較難察覺，當出現尿路刺激征、血尿、水腫等明顯癥狀前來就診，已是晚期，臨床治療復雜、預后差〔2〕。死亡相關蛋白激酶(DAPK)1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與γ-干擾素(IFN-γ)誘導的細胞凋亡，并起關鍵作用〔3〕。有研究發現，DAPK1于包括肺癌、胃癌、CUB等在內的多種惡性腫瘤中表達較正常組織低〔4〕。但國內關于DAPK1 在泌尿系統惡性腫瘤尤其是CUB中的研究鮮有報道。本文通過檢測CUB患者腫瘤組織DAPK1的表達，探討DAPK1在CUB中的發病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年8月至2015年7月我院泌尿外科收治的86例CUB患者，男66例，女20例，年齡28～77〔平均(54.24±7.72)〕歲。其中移行上皮癌27例、鱗狀上皮癌21例、腺上皮癌18例、未分化癌20例。本研究已獲得本醫院的倫理學相關機構批準授權。

1.2 納入標準 均符合《膀胱癌診斷治療指南》中CUB的診斷標準，血常規檢測白細胞計數 ≥4.0×109/L，血小板計數≥8.0×109/L，血紅蛋白≥90 g/L；卡氏功能狀態量表(KPS)評分>70分，預計生存期超過3個月，均有完整的影像學資料；膀胱鏡及臨床病理學檢查均顯示為CUB；年齡≥18歲；患者以及家屬對本研究具體情況了解知情并自愿參與，簽署知情同意書。

1.3 排除標準 ①精神、神志異常不能配合者；②患有嚴重心、肝、腎、肺、腦疾病者；③合并肝癌、腎癌、腦癌等其他惡性腫瘤者；④患有艾滋病、梅毒、病毒性肝炎、結核等傳染病者；⑤患有再障、白血病等血液性疾病者；⑥近3個月接受過化療、放療、介入治療等。

1.4 腫瘤組織DAPK1表達檢測 參考《新編常見惡性腫瘤診治規范》〔5〕。CUB手術后，取腫瘤標本離體后洗凈，確定其大小以及切緣，分別切取癌組織以及腫瘤邊緣超過3 cm的正常膀胱壁組織，分裝入無菌管，進行標記，迅速置于-80℃低溫冰箱備用，采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR檢測DAPK1 mRNA表達)。提取總RNA，在冰上取每例樣本組織50 mg入勻漿器，研磨，恢復正常溫度后，采用4 000 r/min，4℃離心5 min分離雜質，離心后取上層清液，加入500 μl預冷的異丙醇震蕩恢復室溫，12 000 r/min，4℃離心10 min以沉淀DNA，離心后取上層清液，加入1 ml 75%乙醇洗滌RNA 沉淀，震蕩，取離心管底部至白色沉淀物于75%乙醇上漂浮，7 500 r/min，4℃離心5 min吸出乙醇，加入適量的無RNase水以溶解RNA，置于-80℃低溫冰箱備用。采用分光光度計法對RNA濃度、純度進行測定。用免疫組化SP法檢測DAPK1蛋白表達。稱取40 mg標本組織，入勻漿器，研磨，恢復正常溫度后，12 000 r/min，4℃離心10 min備用，將配置好的0.5 mg/ml的蛋白標準液分別按0，1，2，4，8，12，16，20 μl置入標準孔96孔板中，每份磷酸鹽緩沖液(PBS)補足至20 μl，標準孔和樣品孔200 μl二喹啉甲酸(BCA)液，37℃離心30 min，采用酶標儀對各孔波長562 nm處吸光度進行記錄，參照已繪制的標準曲線計算樣品蛋白的濃度。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳得出mRNA表達差異的電泳圖。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件。計數資料用χ2檢驗，組間等級資料比較采用方差分析，計量資料比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 DAPK1 mRNA表達情況 86例CUB組織標本中DAPK1 mRNA陽性表達率為27.91%(24/86)，明顯低于癌旁組織標本中的67.44%(58/86)(χ2=26.94，P<0.05)。

2.2 DAPK1 mRNA的相對灰度值以及DAPK1蛋白表達情況 24例CUB組織標本中DAPK1 mRNA陽性表達相對灰度值(0.26±0.03)明顯低于58例癌旁組織標本中DAPK1 mRNA陽性表達相對灰度值(0.58±0.06)(t=21.33，P<0.05)，CUB組織標本中DAPK1蛋白表達相對光密度值(0.36±0.04)顯著低于癌旁組織標本(0.65±0.06)(t=17.99，P<0.05)。圖1、圖2。

N：癌旁組織；C：癌組織；下圖同圖1 DAPK1 mRNA表達電泳圖

圖2 DAPK1蛋白Western印跡電泳圖

2.3 DAPK1 mRNA表達與CUB臨床病理參數的關系 TNM分期為Ⅰ～Ⅱ級者DAPK1 mRNA表達率〔38.10%(24/63)〕顯著高于Ⅲ級(0%)(P<0.01)，無淋巴結轉移者DAPK1 mRNA表達率〔38.71%(24/62)〕顯著高于有淋巴結轉移者(0)(P<0.01)，癌組織DAPK1 mRNA表達與患者的年齡、性別以及腫瘤部位、大小無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 DAPK1 mRNA表達與CUB臨床病理參數的關系〔%(n/N)〕

臨床病理參數nDAPK1mRNA表達χ2值P值年齡 <50歲4131 71(13/41) ≥50歲4524 44(11/45)0 56>0 05性別 男6627 27(18/66) 女2030 00(6/20)0 60>0 05腫瘤大小 <2cm5435 19(19/54) ≥2cm3215 63(5/32)4 41>0 05

3 討 論

CUB高發年齡為50～70歲，隨著年齡增高發病率增高，男性CUB發病率遠高于女性，約為其的3～4倍〔6〕。CUB的早期篩查在技術上和可行性具有很大的難度，其發病率以及死亡率仍居高不下。CUB早期患者體內即出現生化指標以及代謝紊亂，體液、排泄物質以及組織等出現質與量的改變；此外，腫瘤相關抗原、癌基因以及同工酶等均廣泛存在于宿主細胞內〔7〕。其中，發揮最關鍵性作用的是遺傳突變中癌基因的激活和抑癌基因的失活。

最新研究表明，抑癌基因在癌癥發生發展中的作用不低于原癌基因〔8〕。抑癌基因在癌癥組織中呈低下或者缺失的狀態，如結直腸癌組織中，結腸癌缺失基因(DCC)以及p53等抑癌基因丟失，因此，抑癌基因在一定程度上能夠反映癌癥的表達以及發展。DAPK1即為抑癌基因的一種〔9〕，是一種細胞凋亡正性調節因子，能夠通過激活細胞因子以及原癌基因誘導的過度增生等死亡信號誘導的細胞凋亡抑制細胞癌變。曾有研究顯示，小鼠CUB模型中，DAPK1能夠抑制腫瘤的發生以及轉移〔10〕。有研究發現，來源于CUB以及腎細胞癌細胞系中的20%～30%患者存在DAPK1 mRNA低下甚至缺失〔11〕。證實DAPK1 mRNA與蛋白的表達能夠抑制CBU的發生。

臨床針對DAPK1的研究多針對DAPK1甲基化與腫瘤的關系，于肺癌、胃癌、宮頸癌以及CUB等惡性腫瘤和惡性腫瘤的細胞系中出現啟動子CpG區出現高甲基化〔4〕。本研究證實淋巴結轉移以及晚期CUB患者的癌組織中DAPK1的表達較低，提示DAPK1的表達具有抑制癌組織轉移以及發展的作用。有研究顯示，DNA異常甲基化存在可逆性，應用甲基化轉移酶抑制劑可以逆轉甲基化異常，使出現甲基化的失活抑癌基因恢復其正常功能〔12〕。因此，針對包括DAPK1在內與CUB發生發展具有相關性的抑癌基因異常甲基化和表達水平聯合檢測，可以提高CUB早期篩查的準確性以及靈敏性，同時助于CUB病因、基因靶向治療以及預后的探究。

1 高 放，張鳳梅，李勝水，等.膀胱良、惡性上皮腫瘤中MMP-9的表達及臨床意義〔J〕.現代腫瘤醫學，2014；22(1)：134-6.

2 周 涓，袁學明，梁如生，等.凝血酶聯合冰凍鹽水膀胱灌注治療膀胱癌TURBT術后難治性血尿臨床觀察〔J〕.國際醫藥衛生導報，2015；21(12)：1708-10.

3 張 滿，王建民.死亡相關蛋白激酶與腫瘤的診斷及治療〔J〕.醫學綜述，2008；14(8)：1176-8.

4 楊永姣，劉 莉，陳業剛，等.膀胱癌組織中肺癌腫瘤抑制物1基因啟動子甲基化狀態和蛋白表達及其臨床意義〔J〕.中國現代醫學雜志，2015；25(23)：35-9.

5 中國抗癌協會.新編常見惡性腫瘤診治規范〔M〕.北京：中國協和醫科大學出版社，1999：15-71.

6 溫登瑰，單保恩，張思維，等.2003～2007年中國腫瘤登記地區膀胱癌的發病與死亡分析〔J〕.腫瘤，2012；32(4)：256-62.

7 王 冰，邱 紅.腫瘤標志物在肺癌診斷中的研究進展〔J〕.國際檢驗醫學雜志，2013；34(24)：3384-6.

8 何亞洲，溫桂蘭.原癌基因Pim-1在非小細胞肺癌中的表達及與細胞凋亡的關系〔J〕.廣東醫學，2014；35(19)：3085-8.

9 夏海發，尚 游，姚尚龍.死亡相關蛋白激酶1的分子結構與炎癥調節作用的研究進展〔J〕.中華危重病急救醫學，2015；27(2)：158-60.

10 何凌峰，管考鵬，許克新，等.熱休克蛋白70在小鼠膀胱癌模型中的表達及其與微血管密度的關系〔J〕.中國藥物與臨床，2015；15(11)：1566-7.

11 鐘 華，顧方六，俞莉章，等.白細胞介素6在腎癌和膀胱癌細胞系中的表達〔J〕.中華泌尿外科雜志，1996；17(1)：17-9.

12 李培坤，耿小平，朱立新.DNA甲基化抑制劑研究進展〔J〕.國際藥學研究雜志，2010；37(3)：198-202.

〔2015-10-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省自然科學基金(No.2016J0105)

謝劍云(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)24-6161-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.055

1 福建省中醫藥大學附屬人民醫院腫瘤外科