毛尖蘑粗多糖對(duì)H22荷瘤小鼠P53表達(dá)的影響

羅文哲 呂冬霞 金岳雷 金紹靜 張 虎 王丹丹

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

毛尖蘑粗多糖對(duì)H22荷瘤小鼠P53表達(dá)的影響

羅文哲 呂冬霞 金岳雷 金紹靜 張 虎 王丹丹

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

目的 研究毛尖蘑子實(shí)體粗多糖(MJMP)對(duì)H22荷瘤小鼠P53表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建H22小鼠模型，隨機(jī)分組，觀察記錄小鼠生存狀態(tài)，采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織P53蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)腫瘤組織P53 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化顯示，MJMP可減少突變型P53蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分率，與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)；RT-PCR法表明，經(jīng)毛尖蘑粗多糖處理后，P53 mRNA表達(dá)與陰性對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論 MJMP對(duì)H22腫瘤的抑制作用可能與P53 mRNA及蛋白高表達(dá)有關(guān)。

毛尖蘑多糖；P53；凋亡

近些年人們發(fā)現(xiàn)中藥多糖及其復(fù)合物具有抗腫瘤、增加免疫功能等作用，其中尤以真菌多糖的研究最為活躍〔1～6〕。本研究將毛尖蘑子實(shí)體粗多糖(MJMP)作用于H22荷瘤小鼠，探究其抑瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 H22肝癌細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。毛尖蘑購(gòu)于大興安嶺呼瑪縣韓家園林業(yè)局松濤鹿苑公司；昆明種近交系雌性小鼠，體重18～22 g，購(gòu)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(普通級(jí)，普通環(huán)境飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK黑2006-004)；環(huán)磷酰胺(CTX)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；β-actin多克隆抗體來(lái)自北京博奧森生物有限公司。 Trizol試劑購(gòu)于Gibco公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒購(gòu)于大連Takara生物公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與給藥處理 小鼠常規(guī)建模(空白對(duì)照組不接種腫瘤)，隨機(jī)分組，每組10只，24 h后以灌胃方式給予不同濃度藥物，用藥量均為0.2 ml。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組均予生理鹽水0.2 ml，陽(yáng)性對(duì)照組予CTX 25 mg/kg，高劑量組予高濃度MJMP 40 mg/ml，低劑量組(L)予低濃度MJMP 20 mg/ml。連續(xù)給藥14 d，觀察小鼠生存狀態(tài)。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織P53蛋白表達(dá) 按說(shuō)明書(shū)要求常規(guī)制備小鼠腫瘤組織免疫組化切片。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)，突變型P53陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為黃色。

1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)腫瘤組織P53 mRNA的表達(dá) 按說(shuō)明書(shū)要求以常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR操作。PCR反應(yīng)引物P53：上游5'-GAAACTACTTCCTGAAAACAACGA-3'，下游5'-GCCTCACAACCTCCGTCAT-3'；β-actin：上游5'-AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3'，下游5'-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3'。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，依據(jù)各條帶的光密度和面積對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，以 β-actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算P53/β-actin的值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)采用方差分析(AVONA)，兩兩比較用Q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 H22荷瘤小鼠生存狀態(tài) 將H22細(xì)胞懸液注射至小鼠右腋下，接種后第6天部分小鼠腋下腫瘤肉眼可見(jiàn)，7～14 d時(shí)腫瘤生長(zhǎng)速度較快，通過(guò)肉眼觀察及皮下觸摸，陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤的生長(zhǎng)速度及體積小于其他組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空白對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如、體重遞增、精神狀態(tài)佳；陰性對(duì)照組小鼠活動(dòng)減少、蜷縮，體重減輕，精神萎靡，毛色光澤差；陽(yáng)性對(duì)照組于給藥7 d后小鼠活動(dòng)減少，消瘦明顯；高、低劑量組小鼠基本狀態(tài)良好，體重少量增加。

2.2 P53蛋白表達(dá) 陽(yáng)性對(duì)照組(22.65±4.53)和MJMP治療組(H組28.49±5.62；L組32.84±7.65)與陰性對(duì)照組(65.23±9.52)的P53有顯著差異(P<0.01)。

2.3 P53 mRNA的表達(dá) P53基因在陰性對(duì)照組低表達(dá)(0.16±0.02)，經(jīng)過(guò)CTX和MJMP處理后，P53 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組、低劑量組(L)P53 mRNA表達(dá)量分別為0.30±0.03、0.28±0.02、0.19±0.02。

1、陰性對(duì)照組；2、低劑量組；3、高劑量組；4、陽(yáng)性對(duì)照組圖1 RT-PCR法檢測(cè)H22小鼠腫瘤組織P53 mRNA 的表達(dá)

3 討 論

肝癌是由肝細(xì)胞過(guò)度增殖及細(xì)胞凋亡異常而導(dǎo)致的疾病，肝癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)果，是由細(xì)胞凋亡基因調(diào)控的。因此，綜合多基因的評(píng)價(jià)對(duì)藥物治療肝癌的療效具有重要意義。抑癌基因是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素之一，是細(xì)胞生長(zhǎng)的制動(dòng)器。P53是與腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，被稱為“基因組衛(wèi)士”。

P53基因能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，在人類腫瘤中常發(fā)生變化，可分為野生型和突變型兩種。在正常情況下，野生型P53為其存在形式，但表達(dá)水平較低，很難在細(xì)胞中發(fā)揮作用。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，P53表達(dá)才得到增高，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1靜止期，形成細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，修復(fù)損傷細(xì)胞〔7〕，野生型P53也可誘發(fā)變異細(xì)胞凋亡，控制癌前細(xì)胞的形成。野生型P53的半衰期僅幾分鐘，用免疫組化方法難以測(cè)出。當(dāng)受到藥物刺激時(shí)，野生型P53可被激活，提高其穩(wěn)定性。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，野生型P53可轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃蚉53蛋白。突變型P53失去對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制功能，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。突變型P53穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)聚集比正常細(xì)胞高上百倍，可用免疫組化方法檢測(cè)到。因此，采用免疫組化方法檢測(cè)到的P53基因均為突變型P53基因。

P53主要通過(guò)以下途徑對(duì)細(xì)胞凋亡起到調(diào)控作用：①P53對(duì)外源性凋亡途徑起到調(diào)節(jié)作用，P53能夠激活死亡受體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Fas、DR4、DR5等〔8〕。②P53對(duì)內(nèi)源性凋亡途徑起到調(diào)節(jié)作用。線粒體是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的主要部位，P53可對(duì)線粒體膜的Bcl-2家族蛋白起到調(diào)控作用，如對(duì)Bax/Bak的上游調(diào)控，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕。

本試驗(yàn)結(jié)果提示MJMP能夠減少H22肝癌細(xì)胞中突變型P53蛋白的表達(dá)，增加野生型P53的抑癌功能，減少H22肝癌細(xì)胞的增殖，可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示MJMP抗腫瘤可能與增強(qiáng)小鼠的免疫功能相關(guān)。

1 劉玉紅,王鳳山.真菌多糖結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥學(xué)雜志,2007;42(8):561-4.

2 蘆殿榮,祝彼得,蘆殿香,等.香菇多糖對(duì)正常小鼠以及免疫抑制小鼠免疫功能的影響〔J〕.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004;4(21):20-2.

3 周淑英.黃芪多糖對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的觀察〔J〕.江蘇中醫(yī),1994;15(12):41-2.

4 陳國(guó)榮,楊開(kāi)顏,邵黎明,等.香菇多糖對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響〔J〕.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1996;26(4):225-6.

5 杜澤英.香菇多糖對(duì)人淋巴細(xì)胞IL-2分泌及IL-2R受體表達(dá)雙向調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志,1994;6(1):40.

6 常花蕾.金針菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用及其機(jī)制研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2009.

7 孫淑娟,張清媛.乳腺癌C-erbB-2 Ki-67 p53表達(dá)及意義〔J〕.當(dāng)代醫(yī)學(xué)(學(xué)術(shù)版),2008;(3):100-1.

8 Longley DB,Allen WL,McDermott U,etal.The roles of thymidylate synthase and p53 in regulating Fas-mediated apoptosis in response to antimetabolites〔J〕.Clin Cancer Res,2004;10(10):3562-71.

9 Alvarez S,Drane P,Meiller A.A comprehensive study of p53 transcriptional activity in thymus and spleen of gamma irradiated mouse:High sensitivity of genes involved in the two main apoptotic pathways〔J〕.Int J Radiat Biol,2006;82(11):761-70.

〔2016-05-09修回〕

(編輯 郭 菁)

佳木斯大學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No：Sz2013-002)

呂冬霞(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。

羅文哲(1976-)，男，副教授，碩士，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。

R730.52

A

1005-9202(2016)24-6083-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.017