藥對刺五加-梔子對慢性應激抑郁模型大鼠GSα-PKA-cAMP信號通路的影響

徐向青 孫靈芝 徐向東 吳宏赟

(山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014)

藥對刺五加-梔子對慢性應激抑郁模型大鼠GSα-PKA-cAMP信號通路的影響

徐向青 孫靈芝 徐向東 吳宏赟

(山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014)

目的探討藥對刺五加-梔子對慢性不可預見性應激模型大鼠GSα-PKA-cAMP信號通路的影響及其抗抑郁機制。方法 健康雄性SD大鼠40只，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、藥對刺五加-梔子組，每組10只。采用慢性不可預見性應激方法建立抑郁模型。采用RT-PCR法檢測GSα蛋白的表達；采用ELISA法檢測環磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶(PKA)的變化。結果 給藥4 w后，與空白組相比，模型組GSα蛋白表達和cAMP含量及PKA活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組上述指標表達增強(P<0.01)；與模型組相比，藥對刺五加-梔子組上述指標表達增強(P<0.01)。結論 藥對刺五加-梔子通過調節CUMS大鼠的海馬、前額葉皮層中GSα、PKA、cAMP含量，從而調節GSα-PKA-cAMP信號通路發揮抗抑郁作用。

藥對； 刺五加-梔子； GSα蛋白；環磷酸腺苷；蛋白激酶

抑郁癥除心境低落外，尚表現為興趣喪失、認知功能障礙、意志活動減退、自我評價低、精神運動遲滯、性欲減退、睡眠障礙、焦慮激越等〔1，2〕。這些癥狀與肝郁有別，而具有“志衰不寧”的特點。腎主水藏志、心主火藏神，水火不能交濟，神不能寧，是導致上述癥狀的主要原因。本課題組基于“瀉南補北”的中醫傳統治法，采用藥對梔子-刺五加治療抑郁癥，取得了較好的療效〔3〕。本次研究采用慢性不可預見性應激的方法，研究藥對刺五加-梔子對抑郁癥模型大鼠海馬、額葉皮質GSα環磷酸腺苷(AMP)-蛋白激酶(PKA)信號傳導通路的影響，探討其抗抑郁機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠40只，雄性，二級，5～6個月齡，體重(180±20)g，北京金牧陽實驗動物養殖公司提供〔合格證編號：SCXK(京)2011-0004〕。

1.2 試劑 氟西汀(禮來蘇州制藥有限公司，批號：2061A)；梔子、刺五加(由山東中醫藥大學附屬醫院提供)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Invitrogen公司)，逆轉錄酶(Takara公司)，PCR試劑(羅氏公司)。PCR引物：上海生工生物技術有限公司合成； DEPC處理水(Solarbio)、cAMP酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒、 PKA ELISA檢測試劑盒，Assay公司分裝產品。

1.3 器材 大鼠敞箱(自制)；Morris水迷宮箱(吉量軟件科技有限公司)；高速冷凍離心機(美國Sigma公司)，紫外分光光度計(美國NanoDrop-2000)，PCR儀(美國羅氏480公司)，化學發光成像分析系統(美國Ampharmacia公司)，美國ABI Veriti 96孔型梯度PCR儀；勻漿器(美國IKA公司)，電子分析天平(德國賽多利斯ME235p)，低速自動平衡離心機(德國DT5-3型)，Elx808型全自動酶標儀(美國BioTek公司)，洗板機(美國BioTek公司Elx50型)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與給藥 SD大鼠40只，隨機分為四組，每組10只。①空白組：正常飼養；②模型組：按照慢性溫和不可預見性應激方法制備抑郁模型；③陽性對照組：抑郁模型+氟西汀，氟西汀用0.9%生理鹽水配置(1.8 mg·kg-1·d-1)；④刺五加-梔子組：抑郁模型+藥對刺五加-梔子(2.16 g·kg-1·d-1)。完成造模后連續灌胃給藥 28 d。空白組和模型組以同樣方法灌胃等體積的生理鹽水。

1.4.2 慢性溫和不可預見性應激大鼠模型 建立抑郁大鼠模型，即接受21 d的慢性不可預知性應激刺激，包括禁食24 h 3次、禁水24 h 3次、通宵照明3次、4℃冰水游泳3次、45℃烘箱熱刺激3次、3次夾尾、3次高速水平振蕩。每天隨機安排1種，每種刺激至少出現3次。慢性應激同時，除空白組外，模型組、陽性對照組、刺五加-梔子組大鼠孤養1只/籠。

1.4.3 GSα蛋白含量的變化 各組取10只大鼠，行為學測試后將大鼠斷頭處死，在冰上剝離大腦，取額葉皮層、海馬置于Ep管，保存于-70℃冰箱。按照Trizol試劑要求，采用一步法分別提取額葉皮層、海馬總RNA。取100 mg組織加1 ml Trizol，4℃勻漿破碎樣品，室溫放置10 min，加入0.2 ml氯仿，劇烈振搖15 s，室溫放置3 min，4℃離心(12 000 r/min)15 min，取水相移入新EP管，加等量異丙醇，室溫10 min。4℃離心(15 000 r/min)15 min，棄上清，加75%乙醇1 ml洗滌，4℃離心(15 000 r/min)15 min，棄乙醇。重復洗滌1次，棄上清。取2 μl RNA產物在NanoDrop-2000紫外分光光度計上測濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8～2.0，說明提取的總RNA純度較好。PCR引物：基因引物序列由上海生工生物技術有限公司合成。RT-PCR反應體系：反應總體積20 μl，含PCR Light Cycler 480 SYBR Green ⅠMaster 10 μl，cDNA 2 μl，無RNA酶水6 μl，上游與下游引物各1 μl。RT-PCR循環參數：預孵育95℃，5 min；擴增95℃，10 s，58℃，15 s，72℃，15 s，45個循環；95℃，5 s，65℃，1 min；40℃，10 s。實驗重復次數：3次。引物序列，見表1。

1.4.4 cAMP-PKA含量的變化 末次給藥后1 h，將大鼠斷頭處死，置于冰上迅速剝離大腦，分離額葉皮質、海馬放入凍存管，置于液氮中，儲存于低溫冰箱-70℃保存備用。用ELISA法檢測海馬和前額葉皮層組織中cAMP及PKA的含量。在96孔板上設定空白孔、待測孔及標準孔。空白孔不加任何樣品，標準品孔加入標準品50 μl，待測孔加入樣本40 μl，加入抗體10 μl，依序加生物素化抗體工作液每孔50 μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩搖勻，37℃×60 min；洗板，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，37℃×10 s，重復5次；顯色，顯色底物每孔100 μl，37℃×10 min；依序加入終止液每孔50 μl。檢測波長450 nm時的吸光度，根據標準曲線計算海馬和前額葉皮層組織中cAMP及PKA的含量。

1.5 統計學分析 采用SPSS17.0軟件行Dunnettt檢驗。

表1 引物序列

引物序列(5＇?3＇)GSα上游GCTCAACGACTCTGCCAAATGSα下游TGAAGTGGGTTTCTACGATGCβ?actin上游AGCGAGCATCCCCCAAAGTTβ?actin下游GGGCACGAAGGCTCATCATT

2 結 果

2.1 海馬和前額葉皮層組織GSα含量的變化 與空白組相比，模型組大鼠海馬、前額葉皮層中的GSα含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，經藥物治療后，陽性對照組大鼠海馬、前額葉皮層中的GSα含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，經藥物治療后，藥對刺五加-梔子組大鼠海馬、前額葉皮層中的GSα含量明顯升高(P<0.01)，藥對刺五加-梔子組與陽性對照組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

組別皮層海馬空白組1 02±0 211 02±0 22模型組0 55±0 111)0 55±0 181)陽性對照組1 07±0 252)1 03±0 132)刺五加?梔子組1 07±0 182)1 17±0 202)

與空白組相比：1)P<0.01；與模型組相比：2)P<0.01；下表同

2.2 海馬和前額葉皮層組織PKA含量的變化 與空白組相比，模型組大鼠海馬、前額葉皮層中的PKA含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，經藥物治療后，陽性對照組大鼠海馬、前額葉皮層中的PKA含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，經藥物治療后，藥對刺五加-梔子組大鼠海馬、前額葉皮層中的PKA含量明顯升高(P<0.01)。藥對刺五加-梔子組與陽性對照組比較無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.3 海馬和前額葉皮層組織cAMP含量的變化 與空白組相比，模型組大鼠海馬、前額葉皮層中的cAMP含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，經藥物治療后，陽性對照組大鼠海馬、前額葉皮層中的cAMP含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，經藥物治療后，藥對刺五加-梔子組大鼠海馬、前額葉皮層中的cAMP含量明顯升高(P<0.01)。藥對刺五加-梔子組與陽性對照組比較無顯著差異(P>0.05)。見表4。

組別額葉海馬空白組9 74±0 799 07±0 95模型組6 65±0 991)5 97±1 091)陽性對照組9 71±1 122)9 14±1 602)刺五加?梔子組9 77±0 892)9 35±0 802)

組別額葉海馬空白組36 64±4 2734 20±3 78模型組17 57±2 501)16 27±3 411)陽性對照組36 17±5 292)35 44±5 072)刺五加梔子組36 39±4 282)35 87±4 272)

3 討 論

慢性應激模型是經典的抑郁動物模型，造模大鼠出現的抑郁行為與人類抑郁癥臨床表現類似，且實驗動物的核心癥狀能被藥物改善〔4～7〕。藥對刺五加-梔子具有益腎水、清心火的功效，從現代中藥藥理學角度看，梔子具有抗焦慮、改善學習記憶、中樞抗炎、神經元保護等作用。刺五加具有調節內分泌及免疫增強作用，具有較強的神經元保護作用，能提高體外神經細胞存活率。

受體后信號轉導通路是國內外學者研究抑郁癥發病機理的熱點所在，G蛋白在信息轉導通路中起廣泛和重要的整合、調節及放大作用，G蛋白耦聯的信號通路是抑郁癥研究的主要信號轉導通路〔8〕。GSα-PKA-cAMP信號系統是當前研究較為完善的受體后信號轉導系統。cAMP是目前最早發現的細胞內信使，通過加強G蛋白與腺苷酸環化酶(AC)耦聯，催化ATP水解生成細胞內的第二信使cAMP。很多研究發現，神經遞質的傳導、激素的調節、免疫反應、基因表達以及細胞的增殖和分化均與cAMP有關。cAMP作為第二信使，進一步激活PKA，尤其是抗抑郁藥物對抑郁癥的慢性治療過程中，增強大腦特定部位PKA的活性〔9〕。PKA可以將多種靶蛋白(如細胞骨架蛋白、離子通道、轉錄因子等)磷酸化并調節其活性，其中磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(CREB)，能夠調節多種基因轉錄、神經發育、生長、興奮、凋亡、細胞修復及突觸形成等多個過程，影響個體及整個神經網絡系統的基因表達，對受損傷腦組織神經元的修復與存活也是至關重要的。

大量研究發現，長時間的慢性應激可使大鼠出現抑郁表現〔10，11〕，同時，海馬中GSα-PKA-cAMP通路下調：cAMP水平降低、PKA含量下降、CREB mRNA及P-CREB表達下降。經過抗抑郁藥物治療后，G蛋白中GSα與AC的耦合作用增強，該耦合作用的增強引起不同類型的抗抑郁藥物集中于AC對抑郁癥的治療作用增強。提示，GSα-PKA-cAMP信號通路是抗抑郁治療的靶點之一。

本研究結果顯示模型組大鼠額葉皮質與海馬區GSα、PKA、cAMP表達顯著減少，提示抑郁癥的發生可能與GSα-PKA-CAMP信號通路的變化有關。緊張、恐懼、抑郁等心理應激能夠導致大鼠神經細胞信號通路失衡并出現抑郁樣行為，如GSα、PKA、cAMP含量降低等，從而加重神經元損傷。與模型組相比，藥對刺五加-梔子治療后大鼠額葉皮層與海馬區GSα、PKA、cAMP表達顯著升高，表明藥對刺五加-梔子能明顯提高大鼠額葉皮層與海馬區GSα、PKA、cAMP的表達。

綜上所述，前期研究證實藥對刺五加-梔子有明顯抗抑郁治療作用，其抗抑郁作用機制可能與GSα-PKA-cAMP信號通路上調有關。

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11 蔣 麗.針刺四關穴治療肝郁型抑郁癥的臨床及cAMP-PKA信號通路研究〔D〕.廣州：廣州中醫藥大學，2012.

〔2016-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金資助項目(No.81302956)

孫靈芝(1972-)，女，博士，副主任醫師，主要從事中醫藥防治神經系統疾病研究。

徐向青(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中醫藥防治神經系統疾病研究。

R28

A

1005-9202(2016)24-6063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.007