siRNA技術誘導基因沉默在骨科疾病中的研究進展

農　峰，藍常貢(審校)，廖林波

(右江民族醫學院附屬醫院脊柱骨病外科，百色，533000)

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文獻綜述

siRNA技術誘導基因沉默在骨科疾病中的研究進展

農峰，藍常貢(審校)▲，廖林波

(右江民族醫學院附屬醫院脊柱骨病外科，百色，533000)

【關鍵詞】RNAi；siRNA；基因；骨科疾病

自從1998年Fire等[1]證實Guo等[2]發現的正義RNA抑制同源基因表達的現象為RNA干擾(RNA interference，RNAi)以來，RNAi技術經歷了一個迅速發展的過程。RNAi技術是利用雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)降解細胞內同源信使RNA(messenger RNA,mRNA)，從而阻斷特定基因表達，使細胞出現靶基因缺失的表型[3]，具有高效、特異地沉默目的基因的特點[4]，其種類包括：小干擾RNA(Small Interfering RNAs,siRNA)、微小RNA(Micro RNAs，miRNA)和短發夾RNA(Short Hairpin RNAs,shRNA)。目前，RNAi技術已被視為分子醫學領域的一個重大突破。基于RNAi技術的性質特點及作用，其已被廣泛應用于腫瘤[5]、抗病毒[6]以及遺傳性疾病[7]等研究中。盡管RNAi技術用于骨科疾病的研究尚處于初步階段，但已經取得了一定的進步。筆者就近年來siRNA技術誘導基因沉默在相關骨科疾病(比如骨關節炎、骨肉瘤、骨質疏松癥和股骨頭缺血性壞死)應用方面的研究作一綜述。

1siRNA 技術在骨關節炎中的應用

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種最常見的慢性骨關節疾病，可引起患者的關節活動受限。隨著年齡的增長，OA的發病率會逐漸增加。然而，OA在發生和發展過程中所涉及的確切分子機制尚未闡明。研究表明[8，9]，OA的病因是多因素的，包括遺傳易感性、老化、肥胖、關節畸形或關節損傷等。針對嚴重OA的治療，目前除了全關節置換手術外，尚未發現明顯有效的干預措施來減緩OA的進展或延緩軟骨的退化。隨著基因工程技術的迅速發展，RNAi技術能靶向目的基因的表達。根據RNA干擾技術的獨特性質，其已作為一種有效的工具，被廣泛應用于OA的研究中。缺氧誘導因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,Hif-2α)是一種調節關節軟骨代謝的因子，由EPAS1基因編碼生成。最近的研究表明[10]，在OA患者中，Hif-2α呈現出顯著的高表達狀態，與Muraki等[11]研究結果相一致。這表明，Hif-2α在OA的發生及發展中可能扮演重要的作用。Pi等[12]通過膝關節前交叉韌帶切除術(ACLT)構建小鼠骨關節炎模型，單純向關節腔內注射攜帶Hif-2α siRNA的靶向軟骨細胞納米顆粒發現，siRNA可下調包括Hif-2α在內的多種代謝因子，并抑制降解酶的表達，阻礙關節軟骨的退化。這與Jaffe[13]研究結果相吻合，從而初步表明Hif-2α是誘導關節軟骨退變的重要因子。ADAMTS-5是蛋白多糖酶家族(ADAMTS)中的一員，與關節軟骨退變程度呈正相關[14]。在體內試驗和體外試驗的研究中發現[15]，抑制ADAMTS-5的表達能明顯減輕蛋白多糖的降解、丟失，從而起到保護軟骨旳作用。這說明ADAMTS-5在OA的發病機制中可能發揮至關重要的作用。在鼠類骨關節炎模型的研究中發現[16]，通過向膝關節腔內單純注射慢病毒載體介導的沉默ADAMTS-5基因的siRNA，可引起該基因表達下調，從而抑制關節軟骨的退變。以上學者利用Hif-2α和ADAMTS-5對OA進行研究表明，這兩種因子能影響OA發生的進程。但OA是否還存在其他重要基因需要進一步研究。因此，構建特異的siRNA抑制OA發生及發展相關細胞因子的表達，對OA的發生及發展有一定的抑制或延緩作用。

2siRNA技術在骨肉瘤中的應用

骨肉瘤(Osteosarcoma)是一種最常見的潛在廣泛破壞性的原發性高度惡性骨腫瘤，其病因及相關發病機制尚未闡明。目前，骨肉瘤的治療僅局限于手術及手術前后的化療，雖然這種綜合治療方法在一定程度上能夠改善骨肉瘤患者的狀況，但仍未取得令人滿意的長遠效果。骨肉瘤仍然是目前致殘率和死亡率較高的惡性骨腫瘤之一[17]。最近的報道表明，一些關鍵基因及分子在骨肉瘤的發生發展及分化的過程中起重要的作用，主要包括：脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1(AP endonuclease class I,APE-1)、分化抑制因子(Inhibitor of DNA differentiation,Id)、熱休克蛋白75(Heat shock protein 75,HSP75)等。其中，作為惡性腫瘤之一的骨肉瘤，其發生與DNA修復相關酶的基因突變有密切關系，而APE-1為DNA修復相關酶的重要分子。因此，APE-1可能與骨肉瘤的發生密切相關。APE-1不僅能夠修復DNA，而且還可以氧化還原DNA。基于APE-1這種功能，其可能有望成為治療骨肉瘤的潛在靶點。DAI等[18]在研究轉染了AEP-1-siRNA 質粒的骨肉瘤細胞HOS中發現，13個miRNA發生顯著改變。其中，7個miRNA表達上調而其余6個miRNA表達下調。此外，該研究還發現，發生顯著變化的13個miRNA及其靶基因參與骨肉瘤的發生發展，從而初步闡明AEP-1-siRNA可通過調節相關miRNA靶基因的表達來調控骨肉瘤的發生發展。Id因子又稱DNA 結合抑制因子，是螺旋-環-螺旋轉錄調節因子家族中唯一具有抑制細胞分化、刺激細胞增殖的負性作用的因子。Id因子在多種腫瘤中的異常高表達已經得到研究者的廣泛認可[19～21]。Id因子在骨肉瘤的形成中呈現出高表達狀態[22]。因此，可通過下調Id因子的表達來抑制骨肉瘤細胞的增值。有學者[23]應用特異性針對小鼠 Id1 基因的小干擾 RNA 重組腺病毒(AdsimId1)感染骨肉瘤細胞K7M2-WT，進一步研究 Id1 基因沉默后對骨肉瘤細胞增殖的影響，并通過RT-PCR 及 Western Blot 的方法檢測，結果顯示重組腺病毒 AdsimId1 感染3 d 后 K7M2-WT 細胞 Id1 基因 mRNA 及蛋白水平的表達較非處理組明顯降低，其增殖受到抑制。HSP75-siRNA能夠顯著降低骨肉瘤細胞HSP75蛋白的表達，明顯抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移[24]，表明沉默HSP75能有效抑制人骨肉瘤細胞的增殖和遷移。骨肉瘤的發生發展是多基因綜合作用的結果，病理過程中既有抑癌基因又有促癌基因的作用。從骨肉瘤中發現更多抑癌基因并作為靶向治療的靶點是目前骨肉瘤基因治療的首選方向。因此，利用RNA干擾技術靶向目的基因的表達有望成為骨肉瘤治療的新途徑。

3siRNA技術在骨質疏松癥的應用

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微環境受損及骨強度降低為特征，導致骨脆性增加、易發生骨折的全身性骨病[25]。隨著全球老齡人口的增加和人均壽命的延長，OP的發病率也逐年上升。由于OP可使患者并發脆性骨折而導致殘疾，既影響患者的生活質量又降低其預期壽命，給社會帶來沉重的經濟負擔，已經成為危害公共健康的全球性問題。因此，OP的預防與治療亟待解決。目前，OP的病因及發病機制尚未清楚，有待深入研究。最近的研究發現，在OP的發生及發展過程中，骨形成與骨吸收之間的平衡受到一些重要分子的調控，比如：Dickkopf-1(DDK1)、酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interacting protein 1,CKIP-1)。DKK1是DKKs (Dickkopfs) 家族中的一種分泌型糖蛋白，可抑制Wnt信號通路。原理是：其與Kremen2 結合形成二聚體，所形成的二聚體再與LRP5/6結合形成三聚體，使吸附在細胞膜上的LRP6 內陷而脫離Wnt 復合物，阻斷Wnt信號通路，從而抑制骨的形成。DDK1與骨代謝疾病[26]及腫瘤[27]發生密切相關，在OP患者呈現出高表達狀態。劉媛等人[28]針對 DKK1 基因構建兩段小干擾 RNA(siRNA) 真核表達載體來觀察其對OP大鼠的治療作用，并應用RT-PCR和免疫組化的方法分別檢測股骨DKK1 mRNA及其蛋白的表達，結果發現，與對照組相比，治療組大鼠 DKK1-mRNA 及其蛋白的表達明顯下降。此外，該實驗還通過測定股骨骨密度及病理結構變化發現，治療組大鼠股骨有新生骨小梁形成，骨小梁破壞減輕，從而初步闡明DKK1-siRNA 促進骨形成， 抑制骨吸收， 減輕骨結構的破壞。CKIP-1作為一種新的骨形成負調控因子，在骨細胞形態、生長、分化和凋亡中起關鍵作用。有研究報道，CKIP-1與OP有密切關系[29]。Guo等[30]發現，不論在體外實驗還是體內實驗，將CKIP-1 siRNA轉入成骨細胞或老鼠體內之后，CKIP-1 mRNA及其蛋白的表達明顯下降。另外，該研究的體內實驗還發現，與非處理組相比，處理組的骨量及骨形成標記物顯著增高，從而初步表明CKIP-1 siRNA可促進成骨分化，刺激骨形成，減少骨量丟失。OP發生是一個非常復雜的變化過程，從以上研究提示CKIP-1和DDK1只是OP骨代謝過程中2個重要的調控因子，其他關鍵因子是否也參與了調控過程仍需研究探討。因此，siRNA特異性誘導目的基因沉默有望成為治療OP的新思路。

4siRNA技術在股骨頭缺血性壞死中的應用

臨床上，股骨頭缺血性壞死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)可導致患者髖關節疼痛、活動受限、跛行等，嚴重影響患者的生活質量。近年來，隨著股骨頭缺血性壞死發病率的增加，研究者們越來越關注該疾病。由于ONFH的病因和發病機制尚不完全明確，這給骨科醫生對該疾病的預防和治療帶來了極大的困難。最近的研究[31，32]表明，過氧化物酶體增殖子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)與ONFH密切相關，而關于PPARγsiRNA在ONFH的研究中鮮見。PPARγ是一種能夠調節細胞分化的成脂轉錄因子，可促進干細胞向脂肪細胞發展的同時抑制骨的形成。2015年李勁峰等[33]構建能夠沉默 PPARγ的PPARγsiRNA和表達 CGRP 的雙基因重組載體，將載體轉染的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)植入兔酒精性ONFH模型的股骨頭內，觀察其對酒精性股骨頭壞死的預防效果，發現實驗組股骨頭組織內PPARγmRNA及其蛋白的表達比對照組低，CGRPmRNA及其蛋白的表達高于對照組。初步表明了沉默 PPARγ的PPARγsiRNA和表達 CGRP 的雙基因重組載體能有效阻斷酒精誘導的BMSCs 內 PPARγ mRNA 和蛋白的表達，抑制細胞的成脂分化，同時增加了BMSCs 的成骨相關基因及蛋白的表達，增強了其成骨分化的能力，從發病機制的初始關鍵環節上更高效地預防酒精性 ONFH 發生。ONFH的病因較多，環節復雜，酒精可能只是其中一種病因而已。從上述研究結果顯示PPARγ沉默后能阻斷ONFH的進程，是一個比較理想的基因治療靶點。至于其他原因導致的ONFH是否存在同樣的結果需進一步探討。因此，siRNA誘導股骨頭缺血性壞死發生發展相關基因的沉默，對預防和治療股骨頭缺血性壞死有重要的應用前景。

綜上所述，siRNA誘導目的基因沉默可應用于骨關節炎、骨質疏松癥、股骨頭缺血性壞死、骨肉瘤等多種骨科疾病，并取得了一定的成就，具有良好的應用價值。這只是siRNA對幾種相關骨科疾病的初步認識。然而，RNAi技術尚未完全成熟，并且僅局限應用于活體動物及細胞等基礎研究，其相關藥物還處于臨床驗證階段。雖然siRNA藥物真正應用于臨床尚需時日，但隨著RNAi技術的深入研究，其必將成為治療更多骨科疾病或其他系統疾病的新工具。

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(編輯：梁明佩)

(收稿日期：2016-03-08修回日期：2016-04-22)

中圖分類號：R738.1

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.02.023

作者簡介：農峰，男，在讀碩士研究生。E-mail:nfeng123456@sina.cn▲通信作者：藍常貢。E-mail:landlong120@sina.com

基金項目：廣西醫療衛生重點科研課題(重2012083)；2011年廣西教育廳科研項目(201106LX431)；2010年廣西衛生廳

重點科研課題(桂衛科教〔2010〕22 號)