人腦膠質瘤組織中高遷移率族蛋白B1的表達及其與病理分級的關系

張元峰　孫瑞迅　董孟寧　孫保朝

(南陽市中心醫院神經外科，河南　南陽　473000)

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人腦膠質瘤組織中高遷移率族蛋白B1的表達及其與病理分級的關系

張元峰孫瑞迅董孟寧孫保朝1

(南陽市中心醫院神經外科，河南南陽473000)

目的探討人腦膠質瘤組織中高遷移率族蛋白(HMG)B1的表達及其與病理分級的關系。方法選取外科手術治療后經病理證實的腦膠質瘤標本80例為研究組，另外選擇同期25例行開顱減壓手術的腦外傷患者的正常腦組織為對照組。采用RT-PCR法和免疫組化法檢測人腦膠質瘤組織和正常腦組織中的HMGB1表達，分析表達差異性與病理級別的關系。結果實驗組HMGB1基因表達量(25.371±2.837)明顯高于對照組(6.074±3.309)(P<0.05)；HMGB1蛋白陽性表達率為75.00%，高于正常腦組織中的20.00%(P<0.05)；在病理分級中，實驗組的Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組HMGB1 mRNA表達量(29.835±3.942)顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(21.332±2.253)(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組HMGB1蛋白陽性表達率(76.92%)高于Ⅰ～Ⅱ級(70.73%)(P<0.05)。結論HMGB1在人腦膠質瘤的臨床治療中具有重要指導意義。

膠質瘤；高遷移率族蛋白(HMG)B1

膠質瘤多發于成年男性，主要表現為腦神經功能受損及顱內壓升高，不同類型膠質瘤的發生發展規律不同，給臨床治療造成很大的障礙〔1，2〕。目前臨床上主要通過外科手術、放療及化療治療腦膠質瘤，但是膠質瘤發病急，病情進展迅速，具有免疫逃避功能，與正常腦組織基本無異，即使經過長時間的治療，復發率依然居高不下，患者的5年生存率不足20%〔3〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1主要存在于真核生物細胞內，是一種分布于腦、心、肝、脾及淋巴組織的非組蛋白染色體結合蛋白，參與包括基因轉錄、DNA修復等生物學過程〔4〕。有研究表明 HMGB1的表達與腫瘤的發生、增殖、浸潤、轉移和血管生成等生物學行為聯系緊密〔5〕。本研究探索人腦膠質瘤組織中HMGB1的表達及其與病理分級的關系。

1　對象與方法

1.1標本來源選取2013年5月至2015年4月我院外科手術治療后經病理證實的腦膠質瘤標本80例作為研究組，所有病例均為首次發病且接受手術治療，術前未進行化療、放療及其他治療，患者未患其他重大疾病，臨床資料完整。男45例，女35例；年齡42～71歲，平均(55.85±23.85)歲；病程2～8年，平均(4.87±3.13)年；根據WHO在2007年制定的神經系統腫瘤的分類和分級標準〔6〕：低級別膠質瘤(LGG)(Ⅰ、Ⅱ級)41例，其中室管膜瘤12例，毛細胞型星形細胞瘤8例，少突膠質細胞瘤8例，彌漫型星形細胞瘤13例；高級別膠質瘤(HGG)(Ⅲ、Ⅳ級)39例，其中膠質母細胞瘤9例，間變形室管膜瘤7例，間變形星形細胞瘤10例，髓母細胞瘤5例，惡性少突膠質細胞瘤8例。選擇同期25例我院神經外科行開顱減壓手術的腦外傷患者的正常腦組織作為對照組，男15例，女10例；年齡37～75歲，平均(55.47±5.18)歲。兩組患者的性別及年齡無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。所有樣本取出后立即置入液氮罐保存，試驗過程經倫理委員會通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2試劑及儀器

1.2.1RT-PCR采用總RNA快速抽提試劑盒提取總RNA，購自天根生化科技有限公司；cDNA合成采用cDNA合成試劑盒，購自MBI Ferments；應用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測HMGB1的表達，試劑盒購自Shino-Test Corporation；Taq DNA聚合酶、d-NTP、10倍緩沖液、25 mmol/L MgCl2購自天根生化科技有限公司；HMGB1和GAPDH引物及Taq Man探針序列由天根生化科技有限公司設計；德國SPECTRO公司的紫外分光光度計，澳大利亞Kyratec公司的熒光定量PCR及美國Beckman公司的高速離心機。

1.2.2免疫組化HMGB1單克隆抗體購自美國sigma公司，二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司，熒光顯微鏡由日本Nikon公司提供。

1.3方法

1.3.1RT-PCR(1)提取總RNA和反轉錄合成cDNA：嚴格按照說明書的要求進行操作，使用紫外分光光度計檢測RNA 濃度。(2)實時定量 PCR 檢測：采用天根生化科技有限公司設計的HMGB1和GAPDH引物及Taq Man 探針序列。第一階段95℃預變性5 min；第二階段95℃變性5 s，60℃退火延伸15 s，循環30次；最后40℃終止30 s。每一份標本的HMGB1基因表達量=HMGB1拷貝數/GAPDH拷貝數。

1.3.2免疫組化(1)將標本進行預處理后置于載玻片上，加入單克隆抗體后4℃過夜，使用PBS清洗2次，加入二抗，室溫孵育30 min。滴加過氧化物酶標記，室溫孵育15 min。(2)使用DAB進行顯色，使用清水沖洗兩次，蘇木精復染，常規脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陰性對照使用空白PBS液體。(3)在視野范圍內觀察切片免疫反應強的區域，在高倍鏡(400倍)下觀察5個不重復視野，統計HMGB1陽性細胞數目，取平均值。結果判定標準：染色結果細胞核呈藍色，陽性表達為黃色或黃棕色。陰性：無陽性細胞或陽性細胞數≤5%；陽性：陽性細胞數<5%。

1.4統計學方法采用SPSS16.0軟件行t或χ2檢驗。

2　結　果

2.1HMGB1基因的表達比較實驗組HMGB1基因表達量(25.371±2.837)明顯高于對照組(6.074±3.309)(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織HMGB1 mRNA表達量(29.835±3.942)明顯高于Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤組織(21.332±2.253)(P<0.05)。

2.2HMGB1蛋白免疫組化結果比較膠質瘤組織中的HMGB1陽性表達率為75.00%(60/80)，明顯高于正常組織中的20.00%(5/25)(P<0.01)；在病理分級中，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織陽性表達率〔76.92%(31/39)〕顯著高于Ⅰ～Ⅱ級的70.73%(29/41)(P<0.05)。

3　討　論

膠質瘤是顱內最常見且發病率和病死率最高的惡性腫瘤，臨床治療效果不顯著，預后差。主要是由于膠質瘤生長迅速，快速侵入周圍組織間隙、淋巴管及血管，破壞周圍正常組織，與鄰近正常組織無明顯界限，通過手術難以徹底切除，易復發〔7，8〕。HMGB1具有較小的分子質量(<30 kD)和很高的電泳遷移率。人HMGB1基因在染色體13q12區域，可以編碼219個氨基酸，主要分為三個功能區：A區和B區主要為賴氨酸，其N-末端富含帶正電荷；C區主要為天冬氨酸和谷氨酸，其C-末端富含帶負電荷〔9〕。HMGB1可以通過影響起始復合物的形成增強基因的表達，同時可以通過影響增強體的形成調節基因轉錄過程；另外，HMGB1可造成啟動子和增強子的增強體的結合位點上DNA序列發生變化，促進其他轉錄因子的結合〔4〕。本研究中，膠質瘤組織中HMGB1基因和蛋白表達明顯升高，說明其在膠質瘤的發生、發展中起重要作用，外國學者研究證實HMGB1在腫瘤晚期的表達率為80%，高于其在腫瘤早期的表達率〔10〕，這與我們發現的病理分級對表達的影響也有相同的地方。HMGB1參與腫瘤發生的機制目前還不是很明確，眾多研究結果發現其可能是通過調節基因的表達從而發生腫瘤表型〔11〕，或者HMGB1可以使腫瘤表型的細胞躲避凋亡，激活JAK/STAT途徑，進而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞過度增殖〔12〕。Bassi等〔13〕發現HMGB1可以激活RAGE，表明膠質瘤中存在HMGB1/RAGE信號通路，HMGB1可以通過與RAGE結合，上調RAGE的表達，從而導致細胞外基質降解，使腫瘤出現浸潤和轉移，促進腫瘤的發展。此外，HMGB1還可以促進腫瘤細胞增殖，誘導小血管再生，促進腫瘤不斷增大〔14〕。

1姜方帥.HMGB1、NF-κB及TNF-α在人腦膠質瘤中的表達及臨床意義〔D〕.長沙：中南大學，2014.

2Gass D，Dewire M，Chow L，etal.Pediatric tectal plate gliomas：a review of clinical outcomes，endocrinopathies，and neuropsychological sequelae〔J〕.J Eurooncol，2015；122 (1)：169-77.

3郭兆剛.siRNA法下調PRL-3對腦膠質瘤細胞SHG-44生長周期的影響〔D〕.沈陽：中國醫科大學，2014.

4Ito H，Fujita K，Tagawa K，etal.HMGB1 facilitates repair of mitochondrial DNA damage and extends the lifespan of mutant ataxin-1 knock-in mice〔J〕.EMBO Mol Med，2014；7(1)：78-101.

5張志軍，彭傳會，周琳，等.高遷移率族蛋白B-1的腫瘤生物學效應研究進展〔J〕.中華外科雜志，2012；50(3)：274-7.

6陸新宇，陸培松，李巧玉，等.人腦膠質瘤中神經生長因子表達與組織病理分級及預后的關系〔J〕.中華實用診斷與治療雜志，2012；26(10)：958-60.

7楊李軒，張弩，夏之柏，等.影響惡性膠質瘤生存預后的臨床因素分析〔J〕.中華神經醫學雜志，2012；11(8)：784-7.

8Joel M，Mughal AA，Grieg Z，etal.Targeting PBK/TOPK decreases growth and survival of glioma initiating cells in vitro and attenuates tumor growth in vivo〔J〕.Mol Cancer，2015；14：121.

9Kim B，Song JH，Lee M.Combination of TAT-HMGB1A and R3V6 amphiphilic peptide for plasmid DNA delivery with anti-inflammatory effect〔J〕.J Drug Target，2014，22(8)：739-47.

10Sharma A，Ray R，Rajeswari M.Over expression of high mobility group (HMG) B1 and B2 proteins directly correlates with the progression of squamous cell carcinoma in skin〔J〕.Cancer Invest，2008；26(8)：843-51.

11Meng Q，Zhao J，Liu H，etal.HMGB1 promotes cellular proliferation and invasion，suppresses cellular apoptosis in osteosarcoma〔J〕.Tumour Biol，2014；35(12)：12265-74.

12Limana F，Esposito G，Fasanaro P，etal.Transcriptional profiling of hmgb1-induced myocardial repair identifies a key role for nootch signaling〔J〕.Mol Ther，2013；21(10)：1841-51.

13Bassi R，Giussani P，Anelli V，etal.HMGB1 as an autocrine stimulusin human T98G glioblastoma cells：role in cell growth and migration〔J〕.J Neurooncol，2008；87(1)：23-33.

14Kang R，Tang D，Schapiro N，etal.The HMGB1/RAGE inflammatory pathway promotes pancreatic tumor growth by regulating mitochondrial bioenergetics〔J〕.Oncogene，2014；33(5)：567-77.

〔2015-10-27修回〕

(編輯郭菁)

河南省科技廳科技攻關項目(112102310173)

張元峰(1973-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事腦瘤研究。

R739.41

A

1005-9202(2016)18-4500-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.047

1南陽市中心醫院神經內科