寵物食品中沙門菌的檢測方法概述

孫玉祝，陳江楠，夏兆飛（中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193）

?

寵物食品中沙門菌的檢測方法概述

孫玉祝，陳江楠，夏兆飛
（中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193）

沙門菌是一種人畜共患病病原菌，如果污染寵物食品，將嚴重威脅到人類和伴侶動物的健康安全。寵物食品營養物質含量豐富，有利于沙門菌等有害微生物的生長繁殖。選擇適當的檢測方法，加強對寵物食品監督力度，可以一定程度上有效地降低沙門菌污染的風險，保障人類和伴侶動物的健康。

適用于檢測寵物食品中沙門菌方法很多，可以概括分為傳統微生物學、分子生物學以及免疫學等方法。但是，為了滿足寵物食品快速檢測的需要，逐漸引入試紙條、試劑盒以及自動化檢測儀等快速檢測方法。文章將主要就上述檢測技術的原理和應用進行介紹，比較它們在寵物食品檢測中的實用性以及優缺點，希望為寵物食品中沙門菌檢測提供參考。

1　沙門菌污染及危害

沙門菌污染已經成為世界范圍內寵物食品安全問題關注的重點。由美國食品和藥品管理局（FDA）官方網站發布的信息獲知，美國2014年的10起犬貓食品召回事件中，就有6起是因為懷疑污染或確認污染了沙門菌。新西蘭學者T L Wong等[1]對新西蘭本土生產及分別從澳大利亞、中國和泰國進口的寵物咬膠進行了檢測，不同產地的產品中都檢測出了沙門菌，檢出率分別為6.7%、14%、4.1%和3.7%。國內目前暫時缺乏相關數據，但卻有在魚粉等飼料原料中檢測出沙門菌的報道[2]。

沙門菌可以通過寵物食品感染伴侶動物和人，嚴重威脅人類的健康。動物和人感染沙門菌后，通常會表現出嘔吐、腹瀉或血痢以及發燒等嚴重癥狀，甚至會出現反復感染。2006年至2008年間，美國曾暴發人類感染沙門菌的事件，后經調查證實是由沙門菌污染了寵物食品而引起[3]。

2　沙門菌的檢測方法

2.1傳統微生物學方法傳統微生物學方法是通過給予細菌生長繁殖所需的營養物質，適宜的溫度和足夠長的培養時間，使細菌分裂增殖到可檢測數量，并利用細菌形態、菌落、生化以及血清學等特點進行鑒別的方法。寵物食品樣品中可能含有大量腸桿菌科的細菌而沙門菌含量較少，或樣本中沙門菌受損，直接選擇性增菌容易產生假陰性，所以該方法檢測沙門菌需要預增菌。該方法是沙門菌檢測的一種標準方法，也適合用于其他檢測方法檢測效果的評價。但是從開始接種到最終鑒定操作復雜，費時費力，并不能很好地滿足寵物食品樣本批量快速檢測的需要。

增菌和鑒定兩個過程是該方法的主要限時步驟。對這兩個步驟進行改進，可以明顯縮短檢測時間，增強傳統方法的實用性。免疫磁珠或疏水網膜進行細菌富集可以有效縮短增菌所耗時間，但是如果樣本中沙門菌數量非常少，則易出現假陰性結果。顯色培養基、噬菌體以及電化學阻抗法等則是對鑒定步驟進行改進的方法。例如沙門菌在科瑪嘉沙門菌顯色培養基上會形成典型的紫色菌落。

2.2分子生物學方法分子生物學方法主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、基因芯片、核酸探針以及環介導等溫擴增技術，其中PCR技術應用最廣。

2.2.1聚合酶鏈式反應（PCR）PCR是一項在體外擴增靶基因片段的技術。選取目的菌基因序列中特異性和保守性較高的靶基因，利用PCR技術對靶基因進行擴增，可以實現對致病菌的檢測。沙門菌的invA基因簇編碼吸附和侵襲腸道上皮細胞表面侵襲蛋白，具有較高的屬特異性，可以作為檢測沙門菌的靶基因。根據國內外文獻報道，invA基因編碼的侵襲蛋白是沙門菌的主要毒力因子，以invA基因序列為靶基因設計引物[4]，并采用PCR技術檢測寵物食品中的沙門菌，具有非常高的敏感性和特異性。此外，可應用于PCR檢測的沙門菌屬特異性基因還有：編碼組氨酸轉運操縱子hut基因、16S rRNA基因、編碼鼠傷寒沙門菌腸毒素stn基因[5]及編碼連四硫酸鹽還原酶ttr基因[6]等。引物的特異性是PCR檢測的特異性和是否成功的關鍵，引物特異性低常常會導致檢測中的漏檢和誤檢。因此，使用PCR技術檢測寵物食品中沙門菌前，應對設計或引用的引物進行嚴格的驗證。

傳統PCR技術操作程序包括目的菌的濃集（增菌）、模板制備、PCR擴增以及產物檢測。PCR擴增結果的判讀需要借助凝膠電泳，但是電泳檢測特異性卻并不是很高。此外，傳統PCR還具有步驟繁雜、易污染以及無法準確定量等問題。正是由于如上一些限制性因素，為了更好地實現PCR檢測技術的快捷性和特異性，發展出了很多改進的PCR檢測技術。這些技術不同程度上對傳統PCR操作程序進行了優化。這些技術包括實時熒光定量PCR、Taqman PCR[4]、多重PCR、免疫捕獲PCR以及免疫磁珠分離PCR等。例如，Balachandran，P等[7]利用實時熒光定量PCR技術實現對寵物食品中沙門菌的檢測，檢測結果與標準方法無顯著差異，而且表現出了比標準PCR檢測速度快、可量化以及自動化程度高等優點。

應用PCR技術檢測寵物食品中得沙門菌還需要對樣本進行預處理，排除PCR抑制劑。寵物食品殘渣及與基質有關的抑制劑會干擾PCR檢測靈敏度。國外文獻報道[7]，通過低速離心、濾紙過濾、過濾捕獲（例如，疏水網膜法），以及免疫磁珠捕獲等方式對樣本進行預處理，可以去除樣本中的寵物食品殘渣和基質，顯著提高了沙門菌的PCR檢測敏感性。

2.2.2環介導等溫擴增（LAMP）LAMP是采用可以特異性識別目的基因的四條引物，在恒溫條件下通過DNA聚合酶的催化作用對目的基因進行快速擴增。孫園園等[8]以沙門菌的fim Y蛋白基因序列為目的片段設計了4條特異性引物，并對各種條件進行優化，成功建立了針對動物飼料中沙門菌LAMP快速檢測方法。并對24份樣本重復3次檢測，檢測結果與飼料國標結果一致。該方法具有特異性強、比PCR檢測敏感性高、檢測速度快和不易受干擾等特點。此外，該方法還可以利用氧化硅為載體，實現對寵物食品中沙門菌等多種有害微生物的多重檢測[9]。

2.3免疫學方法免疫學方法是在抗原抗體特異性反應的原理基礎上建立起來的一系列檢測方法，常用于沙門菌檢測的方法包括酶聯免疫吸附（ELISA）、免疫層析技術以及乳膠凝集反應，其中ELISA方法及其衍生方法應用最廣。

ELISA是將抗原抗體特異性反應與酶的高效催化活性的特點相結合而形成的一種固相酶聯免疫分析技術。利用ELISA技術檢測寵物食品中的沙門菌，主要是利用沙門菌抗原高特異性的單克隆或多克隆抗體。利用單克隆（或多克隆）抗體結合樣品中的沙門菌抗原，再加入酶標抗體結合抗原抗體復合物，最終加入底物與酶發生反應，就可以將沙門菌抗原顯色，實現對樣本中沙門菌的檢測。

早在20世紀70年代末，ELISA技術就被用于食品中沙門菌的檢測，隨著技術的不斷改進，發展出很多傳統ELISA的衍生技術，顯著提高了對沙門菌等病原微生物的檢測靈敏度和檢測效率。這些衍生方法包括斑點酶聯免疫（Dot-ELISA）技術、熒光酶聯免疫分析技術、PCR-ELISA檢測技術以及雙夾心法ELISA等。Dot-ELISA技術[2]是采用硝酸纖維素（NC）膜代替傳統的聚苯乙烯反應板，具有吸附力強、操作方便、檢測快速等特點，可以同時檢測多種抗原。但是正式應用前，需要進行標準化預試驗確定適宜反應條件。熒光酶聯免疫分析技術是在傳統ELISA基礎上發展而來，采用熒光底物代替傳統生色底物，可借助儀器進行結果判讀，提高了檢測的靈敏度，避免人工判讀誤差[10]。

2.4快速檢測試紙條和試劑盒常見可用于寵物食品中沙門菌的檢測的試紙有β-萘酚辛酸酯試紙和API試紙。β-萘酚辛酸酯試紙[11]是依據沙門菌屬可以產生特異性較強的辛酯酶解離辛酸酯類化合物的特性而設計的。采用該方法檢測沙門菌具有快速、簡單、直觀和經濟等特點，但是β-萘酚辛酸酯化合物不夠穩定容易分解，保質期短，適合現制現用。API 20 E試紙是根據傳統腸道桿菌生化及發酵反應設計而來，可用于寵物食品和飼料中沙門菌屬的檢測，具有檢測快速及操作簡便（標準化）等特點，是細菌鑒定的國際金標準。快速檢測試劑盒主要是基于單抗酶聯免疫技術、熒光PCR以及實時PCR等原理設計，可以實現短時間內批量產品的檢測，極大地降低人力和時間成本投入。

2.5自動化檢測儀器自動化檢測儀器主要是基于微生物的生化代謝、免疫屬性以及核酸特異性等特點而設計制造的。自動化檢測儀器的出現減少人力和時間的投入，實現短時間內批量樣品的檢測，符合現如今寵物食品批量化生產檢測的需要。現在常用的自動化檢測儀器主要有全自動微生物分析儀和生物傳感器。自動化微生物分析儀還表現出省時、方便操作、可標準化、可追蹤性以及準確度高等特點。

2.5.1全自動微生物分析儀全自動分析儀因設計原理不同可以分為以下幾類：（1）基于微生物生化反應原理設計，例如VITEK微生物鑒定儀和TEMPO全自動微生物定量分析儀。于曉婕等[11]采用TEMPO分析儀對烘干雞肉（寵物食品）微生物污染情況進行檢測，并與傳統標準方法進行比較，兩者符合度程度在97%以上；（2）基于酶聯免疫技術，例如全自動熒光酶聯免疫檢測系統（VIDAS），黃嫦嬌等[10]采用VIDAS系統對食品中沙門菌進行檢測，并與傳統標準方法進行比較，體現出檢測快速、特異性以及敏感性高等特點；（3）以微生物特異的基因組為基礎設計，例如全自動微生物基因指紋分析儀。與傳統方法相比，利用全自動微生物分析儀檢測寵物食品中沙門菌具有很多如上所述的優勢，但是不可避免的一個問題就是高昂的儀器成本，這將會成為阻礙自動化儀器在中小型寵物食品制造企業普及的主要障礙。

2.5.2生物傳感器生物傳感器通常是由生物受體（bioreceptors）和變頻系統（transducing system）兩部分構成。生物受體是生物分子識別原件，可以與待檢物質（如沙門菌）發生生物化學反應，變頻系統也可以稱作信號轉換系統，可以將生物受體與待檢物質的反應信號轉換成可進一步處理的電信號或光學信號。通常可以分為抗體或抗原、酶、核酸（DNA）、細胞或細胞結構以及噬菌體五大類。實際應用的生物傳感器中以酶、抗體和核酸三類生物受體為主。例如，Yang Song等[12]建立以切口酶（一種限制性內切酶）為輔助的生物傳感器，E Delibato等[6]建立以沙門菌的單克隆抗體和多克隆抗體作為生物受體的免疫傳感器；Xiaoyuan Ma等[13]建立以適體（與靶分子特異性結合的寡核苷酸序列）為生物受體的電化學生物傳感器。這幾種傳感器都實現對寵物食品中沙門菌的檢測，表現出較高的敏感性和特異性，并具有檢測快速和操作簡便等優點。此外，也有學者將電化學阻抗技術引入生物傳感器中，檢測結果也表現出了較高的敏感性。

3　結語與展望

雖然僅僅依靠檢測手段并不會從根本上降低寵物食品中的沙門菌等微生物含量，但卻能輔助生產者實現對寵物食品原料供應、生產、存儲以及運輸等環節的科學管理和監控，從根本上降低寵物食品中沙門菌等有害微生物污染的風險。傳統微生物學方法是檢測沙門菌的標準方法，然而檢測耗時就成為該技術在實際應用中的“瓶頸”。鑒于此，分子生物學技術、免疫學技術、快速檢測試劑（盒）以及自動化檢測儀器等檢測技術手段的引入，豐富寵物食品中沙門菌的檢測方法，滿足寵物食品工業批量準確快速檢測的需要。隨著技術的不斷更新，我們相信會有越來越多的先進技術會被用于寵物食品中沙門菌的檢測，寵物食品中沙門菌的檢測技術也將更精確、簡便和快捷，提升寵物食品安全，為伴侶動物和人類健康提供保障。

參考文獻：

[1] Wong T L，Thom K，Nicol C，et al.Salmonella serotypes isolated from pet chews in New Zealand[J] . J Appl Microbiol，2007，103 （4）：803-810.

[2]韓志輝，張紅見.飼料中沙門氏菌的分離鑒定與Dot-ELISA檢測[J].安徽農業科學，2011，39（26）：16139-16140，16163.

[3] B Casey Barton，F Aimee，D Marshall，et al . Human Salmonella infections linked to contaminated dry dog and cat food，2006-2008[J].Pediatrics，2010，126（3）：477-483.

[4] JIA Jun-tao，CUI He，MA Yun，et al.Taqman PCR- based Methods for Rapid Detection of Salmonella in Pet food[J] . Chinese Food Science，2012，1（3）：32-34.

[5] C J Ziemer，S R Steadham.Evaluation of the specificity of Salmonella PCR primers using various intestinal bacterial species[J] . Letters in Applied Microbiology，2003，37（6）：463-469.

[6] E Delibato，G Volpe，D Stangalini，et al . Development of SYBR Green Real Time PCR and a Multichannel Electrochemical Immunosensor for Specific Detection of Salmonella enterica[J] .Analytical Letters，2006，39（8）：1611-1625.

[7] P Balachandran.M Friberq，V Vanlandinqham，et al.Rapid detection of Salmonella in pet food：design and evaluation of integrated methods based on real-time PCR detection[J].J Food Prot，2012，75（2）：347-352.

[8]孫園園，趙鵬.動物飼料中沙門氏菌環介導等溫擴增（LAMP）快速診斷方法的建立[J].中國畜牧獸醫，2012，39 （1）：32-36.

[9] C Duarte，E Salm，B Dorvel，et al.On-chip parallel detection of foodborne pathogens using loop-mediated isothermal amplification [J].Biomed Microdevices，2013，15（5）：821-830.

[10]黃嫦嬌，黃曉蓉，鄭晶，等.全自動熒光酶聯免疫方法檢測食品中沙門氏菌[J].安徽農業科學，2010，38（10）：5320-5321，5323.

[11]饒正華，索德成，楊曙明.β-萘酚辛酸酯試紙法快速檢測飼料中的沙門氏菌[J].飼料研究，2005，6：45-47.

[12] Y Song，W Li，Y Duan，et al.Nicking enzyme-assisted biosensor for Salmonella enteritidis detection based on fluorescence resonance energy transfer[J].Biosens Bioelectron，2014，55：400-404.

[13] X Ma，Y Jiang，F Jia，et al . An aptamer-based electrochemical biosensor for the detection of Salmonella[J].J Microbiol Methods，2014，98C：94-98.

通訊作者：夏兆飛，E-mail：drxia@126.com

作者簡介：孫玉祝（1988-），男，碩士，主要從事小動物營養學和內科學研究，E-mail：vetsunyuzhu@126.com

收稿日期：2014-12-17

中圖分類號：S852.61+2

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0087- 03