豬流感的流行現狀及分子生物學診斷方法研究進展

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬流感的流行現狀及分子生物學診斷方法研究進展

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、高度接觸性豬呼吸道傳染病，給養豬業造成很大的危害，豬流感病毒也可感染人類，威脅人類的生命健康。文內通過綜述我國豬流感的流行現狀及分子生物學診斷方法的研究進展情況，以期對豬流感的診斷和防控工作提供參考。

豬流感；流行現狀；分子生物學；診斷

豬流感(swine influenza，SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。該病有明顯的季節性，早春、深秋和寒冷的冬季多發，各種年齡、性別和品種的豬均可感染[1]，臨床表現主要是發病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[2]。SIV可損害豬免疫系統，引起免疫抑制，繼發感染其他疾病，加劇病情，降低生產性能，給養豬業造成巨大的經濟損失。由于豬呼吸道內同時具有人流感和禽流感的唾液酸受體，因此，豬是禽、豬、人流感病毒共同易感宿主，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”[3]，豬流感的公共衛生學意義日益突出，在流感大流行中起著重要的作用[4]。本文簡要綜述了近年來我國豬流感的流行現狀與SIV分子生物學診斷方法研究進展情況，希望廣大基層獸醫工作者對SI引起足夠的重視，從而建立有效的診斷和防控機制，最大程度地減輕SI對養豬業所造成的危害。

1 我國豬流感流行現狀

1918年美國首次報道了豬流感[5]，迄今為止，歐、美、非、亞、澳等世界各大洲均有豬流感的發生和流行。目前，已經分離的血清型有H1N1、H1N2、H2N3、H3N1，H3N2、H1N7、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等，在我國豬群中流行較廣的主要是H1N1，H1N2和H3N2，也有H5N1和H9N2感染豬的相關報道[6-7]。王進香等[8]采用血凝抑制試驗(HI)對寧夏22個縣(區、市)43個規模豬場、10個屠宰場、197個散養戶的1 710份豬血清樣品進行了豬流感病毒H1、H3亞型抗體的檢測。結果顯示，被調查的樣品中，H1亞型抗體陽性率為11.81%，H3亞型抗體陽性率為0.46%，H1+H3亞型抗體陽性率為0.35%。劉旭等[9]對甘肅省14個地、市、州規模化養豬場未免疫流感疫苗的380份豬血清進行了豬流感H1N1、H3N2、H5和H9抗體檢測，結果發現在多個市、州的豬群中檢出H1N1、H3N2、H5和H9抗體，陽性率分別為35.26%、28.15%、1.05%和7.89%。陳錦成等[10]采用HI對采集于廣東、湖南、河南省12個市縣28個規模化豬場的799份血清進行H1和H3亞型豬流感病毒的抗體檢測。結果表明，H1亞型抗體陽性率在0～83.33%之間，豬抗體總陽性率為46.18%(369/799)，豬場陽性率為89.29%(25/28)。H3亞型抗體陽性率在0～100.00%之間，豬抗體總陽性率為61.33%(490/799)，豬場陽性率為85.71%(24/28)。廣東、湖南和河南地區H1亞型抗體陽性率分別為48.91%、40.26%和50.67%，H3亞型抗體陽性率分別為58.55%、70.78%和 78.67%。在被調查的上述3個地區的豬群中，H1和H3亞型豬流感病毒的感染較為普遍，其中H3亞型感染率高于H1亞型，且各地區豬流感病毒的流行情況存在地域性差異。李凱航等[11]2011年對上海市46個場戶的723份豬血清應用HI和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行了檢測。結果顯示：該市豬群中豬流感病毒的H1亞型為優勢亞型，H3亞型病毒感染率較低，被檢場戶流感病毒抗體的場陽性率為1.25%～100%，樣品陽性率為1.3%～74.7%。曹振鵬等[12]采用ELISA方法和HI對2011—2012年采集的1 050份血清樣品進行SIV血清學檢測。兩種檢測方法結果顯示1 050份血清樣品中SIV抗體陽性率分別為50.4%(ELISA)和50.2%(HI)。其中珠三角地區和粵東地區的感染率高于粵西地區。SIV亞型調查結果顯示該地區流行的SIV主要為H1和H3亞型，抗體陽性率分別為39.2%和18.2%(ELISA)。部分豬場存在H9亞型SIV抗體。部分豬群中同時存在H1和H3兩種亞型SIV抗體，表明豬群中存在不同亞型SIV混合感染。劉麗萍等[13]于2012年10月至2013年12月從全國養豬重點省份的養殖場、屠宰場采集豬血清樣品共計5 856份，采用HI進行豬流感抗體檢測。結果顯示，我國豬群中SIV抗體陽性率分別為55.52%、13.92%和2.00%，其中H1N1 SIV抗體平均陽性率高于其他亞型。2013年1月和3月份，又集中在廣東和湖南兩個省份的部分養殖場和屠宰場采集豬血清樣品共計9 910份，采用ELISA進行抗體檢測。結果共檢出陽性血清3 518份，平均陽性率分別為36.14%和34.89%。王剛等[14]于2009—2014年期間分別從西藏林芝、拉薩、山南、日喀則、昌都和那曲等地區隨機采集豬血清1 537頭份，采用ELISA法進行抗體檢測。結果表明：西藏地區SIV H1N1抗體陽性率達71%，SIV H3N2抗體陽性率達27%，SIV H1N1和H31N2抗體陽性重復率達19%。何淑儀等[15]采用HI，對2013—2014年從5個省份采集的2 208份血清樣品進行SIV血清學檢測，結果顯示陽性血清共1 269份(57.42%)，其中廣東省和廣西省的感染率最高(P＜0.01)。H1N1 SIV、H3N2 SIV抗體陽性率分別為22.51%、32.97%。H1N1 SIV和H3N2 SIV在冬季血清陽性率最高，然而在冬末(2月)陽性率卻最低(P ＜0.01)。母豬的H1N1 SIV抗體陽性率高于仔豬和育肥豬，但仔豬的H3N2 SIV抗體陽性率卻比較高。隋金鈺等[16]分別對2013年11-12月期間采集于福建等9個重點養豬省份的2 198份以及2014年3-4月期間采自于廣東和湖南兩省的3 654份豬血清樣品進行了血凝抑制抗體的檢測。結果顯示，2013年我國豬群中歐亞類禽型豬H1N1、2009/H1N1、H3N2 SIV、H5N1 AIV、H9N2 AIV及H7N9流感病毒平均抗體陽性率分別為49.73%、11.87%、1.71%、0、0、1.36%，2014年分別為48.52%、12.10%、1.04%、0、0、2.05%。

2 豬流感病毒分子生物學診斷方法研究進展

2.1 核酸探針

核酸探針技術是常用的分子生物學診斷技術，它具有操作簡單，不受抗原抗體反應的限制，結果易于判定等優點。Junk等用非放射性地高辛標記的582個堿基cDNA探針來檢測A型H1N1 SIV編碼核蛋白的RNA，陽性細胞呈明顯的暗黑色，證明該探針有較好的特異性和敏感性。呂翠等[17]以地高辛標記SIV基質蛋白(M)基因的保守片段制成核酸探針，與H1及H3亞型的SIV的cDNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的cDNA、豬圓環病毒2型的DNA、豬瘟病毒cDNA、豬偽狂犬病的DNA進行斑點雜交，以檢測探針的特異性，結果該探針僅與H1及H3亞型的SIV的cDNA雜交呈陽性，與其余病毒雜交呈陰性，敏感性試驗顯示，探針最低能檢出約5 pg的H3亞型的SIV RT-PCR產物，應用該探針對35份疑似SI臨床病料進行檢測，結果檢出9份陽性，與RT-PCR檢測結果一致。

2.2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進行反轉錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速、靈敏等優點在動物疾病診斷上得到了廣泛的應用。王隆柏等[18]根據GenBank發表H1N1、H1N2和H3N2亞型豬流感病毒M基因片段的引物序列，設計合成1對引物，建立豬流感病毒RTPCR檢測方法。結果顯示，該法能擴增出675 bp的基因片段，同條件擴增的偽狂犬病毒、豬瘟病毒、圓環病毒2型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為陰性，可檢測到3.5 pg豬流感的核酸，能從被流感病毒感染的小白鼠和疑似豬流感的病料中檢測到SIV。

2.3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在單一PCR基礎上發展起來的，通過寡核苷酸引物組合，在一個PCR反應體系中同時擴增多個靶序列，其擴增的特異性和效率與單一PCR相當，但同時可擴增針對不同模板的多個靶序列，能節約時間和精力。齊海濤等[19]根據GenBank中H1N1和H3N2亞型SIV血凝素、神經氨酸酶和M基因保守序列，分別設計合成了5對特異性引物，利用RT-PCR技術對SIV的型和亞型進行鑒定。結果表明，該方法的型RT-PCR可以檢測出104EID50病毒量所提取的RNA，H1、H3、N1和N2的亞型RT-PCR均可以檢測出104EID50病毒量所提取的RNA。除每對特異性引物所對應的亞型外，對其他亞型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的檢測均為陰性。王洪光等[20]根據GenBank登錄的相關病毒基因序列，選擇保守區域設計引物，經過反應條件的優化，建立了可同時檢測以豬繁殖與呼吸綜合征病毒與SIV的RT-PCR診斷方法，擴增的目的片段長度分別為364 bp和981 bp。通過實驗證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒和SIV的核酸檢測最低濃度分別為3.2×10-3ng和2.7×10-3ng。應用該方法對32份臨床樣品進行檢測發現，豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性率為43.8%，SIV陽性率為31.3%，二重感染率為9.4%。韋冠東等[21]根據GenBank登錄的相關病毒基因序列，選擇保守區域設計引物，經過反應條件的優化，建立了可同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒與SIV的三重RT-PCR診斷方法，擴增的目的片段長度分別為364 bp、530 bp和981 bp。通過實驗證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和SIV的核酸檢測最低濃度分別為3.2×10-2ng、8.3×10-2ng和3.7×10-2ng。

2.4 熒光定量RT-PCR方法

實時熒光定量PCR是融匯了傳統PCR技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點。張太翔等[22]選取SIV的核蛋白基因序列設計引物和探針，建立了檢測SIV的TaqMan實時熒光定量PCR方法。以梯度稀釋的含有SIV目的擴增片段的質粒作為標準品，進行定量PCR反應以確定檢測靈敏度。2.0×108至2.0×102拷貝/μL 7個數量級的范圍內定量PCR有“S”型擴增曲線，檢測靈敏度為20個拷貝/μL，并根據病毒拷貝數與Ct值的關系繪制了標準曲線。該方法具有特異性，對豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸都沒有擴增反應。劉好朋等[23]根據H1亞型SIV血凝素基因保守序列，分別設計并合成1對特異性引物和1條TaqMan MGB探針，建立檢測H1亞型SIV的一步法實時熒光定量RT-PCR技術。結果顯示，該方法的敏感性可達102拷貝/ μL，除H1亞型SIV外，對H3N2亞型SIV、H9N1亞型SIV、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒的檢測均為陰性，且應用該方法對疑似豬流感樣品進行檢測，其結果與SPF雞胚分離病毒方法結果的符合率為94%。王建華等[24]分別根據尼帕病毒(NiV)和SIV的M基因序列設計引物和TaqMan-MGB探針，通過優化反應條件建立了一種鑒別NiV和SIV的雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對該方法的定量線性范圍、敏感性、重復性和特異性進行了評價及初步應用。結果顯示，用該方法檢測NiVM基因的RNA標準對照(NiV-M-RNA)和SIVM基因的RNA標準對照(SIV-M-RNA)，定量線性范圍分別為4.6×101copies/ μL-4.6×108copies/μL和 5.8× 101copies/μL-5.8×108copies/μL，檢出限分別為46個拷貝和58個拷貝。該方法的組內試驗和組間試驗的變異系數均小于1.6%，顯示其良好的可重復性。該方法僅對NiV-M-RNA和SIV呈現特異性擴增曲線，不與豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒2型和偽狂犬病病毒發生交叉反應。

2.5 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本學者Notomi等發明的一項恒溫核酸擴增技術，具有操作簡便、快速、敏感、特異等特點，特別適合在現場和基層部門應用。蘇霞等[25]從GenBank中獲得H1N1 SIV血凝素、神經氨酸酶基因序列，應用DNAStar軟件MegAlign程序分析其序列，利用Primer ExplorerV4軟件在序列保守區域設計LAMP引物，即外引物和內引物，同時以H1N1 SIV的cDNA作為陽性模板，對實驗中的幾個反應條件進行優化。建立H1N1 SIV LAMP快速檢測方法。結果顯示，該法對H1N1 SIV的靈敏度達到4～6個拷貝，其引物對于H9亞型禽流感病毒、豬瘟病毒和豬圓環病毒均無非特異性擴增，表現出良好的特異性。張莉等[26]針對SIV NP基因保守區域設計并合成6條引物，建立了SIV的LAMP檢測方法，并進行了特異性、敏感性和重復性試驗。結果顯示，該方法可特異性檢測H1N1、H1N2、H3N2、類禽H1N1亞型SIV及甲型H1N1流感病毒，但不能檢測出豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒2型、日本乙型腦炎病毒，該方法的最低檢測量為100拷貝/μL質粒DNA。

3 小結與展望

SI是一種世界性的豬的呼吸道傳染病，在豬場內廣泛存在，是規模化養豬場的常發病，并呈現地方流行性，單純感染SIV后，豬死亡率并不高，但SI是一種免疫抑制性疾病，容易導致其他病原繼發感染，造成豬大量死亡。SIV能感染人，威脅人的生命安全，因此，平時要加強豬飼養管理和日常衛生消毒工作，降低飼養密度，增強豬的抵抗力，控制好豬只和人員進出，防止疫病的傳入，可以定期免疫現有滅活疫苗，有條件的豬場也可分離出相應毒株，委托一些生物制品企業生產自家苗。對已發生豬流感的豬場，對全群豬緊急免疫接種滅活疫苗，并肌注抗生素，避免其他細菌病的繼發感染，隔離病豬，保證病豬的休息和營養，加強管理，防止病毒傳播。一旦發現豬疑似感染豬流感，一定要做好個人防護工作，盡量佩戴口罩、手套、帽子，接觸后洗手、洗澡，避免感染SIV。

SI及時準確的檢測對其防控意義重大，目前SI的血清學檢測方法主要有HI和ELISA，但這些方法不能區分是疫苗毒還是野毒產生的抗體，而病原檢測中病原分離、鑒定的檢測方法雖然準確、可靠，但耗時太長，滿足不了臨床快速確診的需求，因此，需要采用近幾年發展起來的分子生物學方法進行檢測，雖然目前已經建立了多種分子診斷方法，在臨床SI的診斷中起到了一定作用，但這些方法都有利有弊，如常規RT-PCR方法敏感性不夠高，可能造成漏檢，且不能實現對病毒的定量檢測，熒光定量RT-PCR方法可彌補常規RT-PCR的缺點，但對人員和設備儀器要求太高，基層人員不易掌握儀器的操作使用和結果的分析，需要儀器和耗材的維持運作費用較高，不適合獸醫基層單位大規模推廣和應用。LAMP方法檢測快速、簡便，適合在基層獸醫和養殖場進行推廣使用，但容易出現假陽性結果，上述檢測試劑的核酸檢測試劑均需要冷凍保存，成本高昂且運輸半徑極其受限，隨著分子生物學技術的不斷發展，目前對其他疾病的檢測方面已經研制出了基因試紙卡檢測盒，具有LAMP檢測方法的優點，又能避免假陽性的出現，操作簡單，全程時間短，最重要的是檢測試劑不需要冷凍保存，易保存和運輸，適合基層獸醫部門應用，筆者認為基因試紙卡及其配套適合攜帶的簡易核酸制備設備是未來SIV檢測試劑的研究方向。

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2016-05-10）

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-06-022-15) ，山東省自然科學基金項目(ZR2013CQ006)，山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2014CQ010）

于新友(1983-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究