順鉑誘導食管癌EC9706耐藥細胞中Bcl-2的表達

銀　瑞　董新偉　王　錚

(南陽市中心醫院 胸外科，河南　南陽　473009)

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順鉑誘導食管癌EC9706耐藥細胞中Bcl-2的表達

銀瑞董新偉王錚

(南陽市中心醫院 胸外科，河南南陽473009)

〔摘要〕目的探討凋亡抑制蛋白Bcl-2在順鉑(DDP)誘導食管癌EC9706耐藥細胞中的表達。方法建立EC9706/DDP細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞存活率，Western印跡檢測DDP處理后EC9706細胞及EC9706/DDP細胞Bcl-2蛋白表達，RT-PCR、熒光定量PCR檢測Bcl-2 mRNA水平。結果EC9706/DDP細胞對DDP誘導的凋亡不敏感，Western印跡檢測到EC9706/DDP細胞中Bcl-2表達上調，與EC9706細胞相比具有統計學意義(P<0.05)。RT-PCR、熒光定量PCR檢測到EC9706/DDP細胞中Bcl-2 mRNA水平上調，與EC9706細胞相比具有統計學意義(P<0.05)。結論Bcl-2表達上調可能為食管癌EC9706細胞對DDP耐藥的重要機制。

〔關鍵詞〕Bcl-2；食管癌；順鉑；耐藥

第一作者：銀瑞(1973-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事胸外科疾病的臨床診治和基礎研究。

食管癌的治療方案中，化療一直占有重要地位，但腫瘤細胞對化療藥物的原發或繼發性耐藥，以及腫瘤細胞的凋亡缺陷或受阻常導致化療的失敗〔1〕。已知Bcl-2家族在調節細胞程序性死亡及提高腫瘤細胞對化療藥物敏感性方面發揮著重要作用，其重要成員Bcl-2基因在包括食管癌在內的多種腫瘤組織中可過度表達，并不同程度地抑制化療藥物介導的細胞凋亡〔2〕。本研究觀察順鉑(DDP)誘導食管癌細胞株EC9706耐藥細胞中Bcl-2的表達，旨在探討EC9706細胞對DDP耐藥的機制。

1材料與方法

1.1材料人EC9706細胞由河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室保存；RPMI-1640培養基、購自美國Gibco公司；小鼠抗人Bcl-2單抗購自CST公司；小鼠抗人β-actin單抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋公司；β-actin 及Bcl-2 引物由上海生物公司合成；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma公司；DDP購于山東齊魯制藥有限公司。

1.2細胞培養EC9706細胞在含有10%小牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養基中于37℃、5%CO2飽和濕度下進行培養。將DDP溶于乙二胺四乙酸(DMSO)配成1 mmol/L的儲存液，于-20℃下保存。細胞傳代后24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，對照組更換新鮮培養液，實驗組加入DDP，收集備用。

1.3EC9706/DDP耐藥細胞的建立選取對數生長期的EC9706細胞，DDP作用濃度從0.03 μmol/L開始，48 h后棄去培養液并加入新鮮培養液繼續培養，觀察無明顯死亡細胞后選擇對數生長期細胞進行傳代，增加25%~50% DDP藥物濃度，反復傳代，使之穩定，直至該細胞株能在0.3 μmol/L的DDP濃度下長期生存。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率將處于對數生長期的EC9706與EC9706/DDP細胞接種于24孔板培養過夜，選擇不同劑量的DDP作用于EC9706、EC9706/DDP細胞。收集24孔板中上清液，各孔用PBS洗滌1遍，1 200 r/min離心10 min，棄去上清液，每孔再加入750 μl碘化丙啶(PI)染液，37℃避光，作用20 min后收集，4℃避光過夜，于流式儀檢測，用WinMDI 2.9軟件分析，有G1期DNA含量的細胞比例即細胞凋亡率。

1.5MTT法檢測細胞存活率將處于對數生長期的EC9706、EC9706/DDP細胞分別接種于96孔板，于37℃、5% CO2溫箱培養3 d，加入不同濃度的DDP，每孔加MTT溶液20 μl，孵育4 h，終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔加150 μl DMSO并振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，測定各孔吸光值，記錄結果。

1.6Western印跡法檢測Bcl-2蛋白表達收集細胞并使用預冷PBS洗滌2遍，加入裂解液，冰上孵育30 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，將已定量好的細胞總蛋白與緩沖液等量混合，沸水煮3~5 min備用。20 μg總蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，移至硝酸纖維素膜，轉膜后用5%脫脂牛奶/Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉2 h，加入一抗β-actin、小鼠抗人Bcl-2，按1∶1 000稀釋，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min。用電化學發光法(ECL)試劑盒進行顯影曝光。

1.7RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測Bcl-2 mRNA表達TRIzol法提取EC9706/DDP細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明，將RNA逆轉錄成cDNA。再以逆轉錄出的cDNA為模板建立反應體系。β-actin引物序列：正義：5′-GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT-3′，反義：5′-GTCACACTTCATGA-TGGAGTTGAAGG-3′。Bcl-2引物序列：正義：5′-TTCGCCGAGTCCAGGC-3′，反義：5′-TCACTTGTG-GCCCAGATAGC-3′。95℃預變性5 min，95℃變性30s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min，產物在瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.8實時熒光定量PCR檢測Bcl-2基因在細胞內mRNA的表達Bcl-2檢測引物如上述，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為內參，正義：5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，反義：5′-ACGGTGCCATGGAAT-TTGCC-3′，擴增長度 196 bp，反應體系為10 μl，含上、下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，雙蒸水6 μl，熒光定量PCR反應混合液10 μl。應用ABI7500 Fast型實時熒光定量PCR儀進行PCR反應，并設定運行參數：95℃ 3 min預變性，然后95℃ 5 s變性，60℃ 25 s退火與延伸，40個循環，并使用軟件分析相對表達量(RQ)。

1.9統計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1EC9706/DDP與EC9706細胞形態比較顯微鏡觀察EC9706細胞呈圓形，大小均一，形態規則。而EC9706/DDP大小不均一，形態不規則，可見瘤巨細胞和凹陷。

2.2DDP誘導EC9706/DDP與EC9706凋亡率比較用不同濃度(0.2、0.3、0.4 μmol/L)DDP誘導EC9706/DDP與EC9706細胞48 h，兩組細胞的凋亡率分別為(2.08±0.99)%、(7.52±0.86)%、(9.25±1.02)%和(4.56±0.56)%、(25.35±1.22)%、(40.21±0.93)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3DDP對EC9706/DDP與EC9706的增殖抑制作用比較分別采用不同濃度的DDP(0.2、0.3、0.4 μmol/L)作用于EC9706/DDP與EC9706細胞48 h后，MTT法檢測細胞存活率分別為(95.23±2.32)%、(92.03±2.88)%、(88.23±2.96)%和(89.53±0.88)%、(82.13±1.96)%、(78.52±3.11)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4DDP作用于EC9706/DDP和EC9706后對Bcl-2蛋白表達的影響Bcl-2在EC9706細胞株中表達下調，與0 h蛋白表達量比較，在6 h后開始降低(P<0.05)；同時Bcl-2在EC9706/DDP細胞株中表達明顯上調，與0 h蛋白表達量比較，在6 h后開始升高(P<0.05)。兩組間比較差異顯著(P<0.05)。Bcl-2在兩組細胞中的表達差異說明抗凋亡蛋白Bcl-2變化可能在DDP耐藥機制中起重要作用。

2.5DDP誘導耐藥細胞株EC9706/DDP中Bcl-2 mRNA表達水平變化在明確了DDP作用EC9706/DDP后Bcl-2蛋白水平是上調的，進一步探討mRNA水平的變化。采用特異性引物通過RT-PCR反應檢測Bcl-2 mRNA水平也是上調的，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明Bcl-2的變化受到轉錄水平上的調控。通過實時熒光定量PCR計算相對定量結果顯示，Bcl-2 mRNA在EC9706細胞、EC9706/DDP細胞中RQ分別為0.032±0.002、0.481±0.001，EC9706/DDP細胞mRNA的表達水平明顯高于EC9706細胞(P<0.05)。

3討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，指細胞在一定條件下通過啟動內部機制，經過一連串的細胞變性，最終發生死亡的過程〔2〕。目前對Bcl-2、p53、bax等凋亡調控基因研究較多，通常認為bax和p53誘導凋亡，而Bcl-2則抑制凋亡〔3〕。Bcl-2基因是1984年Tsujimoto等〔3〕從與濾泡性淋巴細胞瘤相關的染色體易位的斷裂點克隆到的一種癌基因，Bcl-2蛋白過度表達，可抑制細胞的凋亡并延長細胞壽命，參與腫瘤發生，Bcl-2的這一作用通常認為是通過封閉細胞核轉運、抑制細胞內鈣離子濃度增高等途徑實現的。Bcl-2作為細胞凋亡的強抑制基因，在許多腫瘤細胞中高表達，臨床研究發現，Bcl-2基因的表達與淋巴結轉移、血管損害、p53異常表達和細胞凋亡的發生呈負相關，在中、晚期癌癥中Bcl-2的表達更強〔4〕。

化療藥物耐藥是影響化療效果的重要因素，凋亡抑制基因Bcl-2能抑制化療藥物介導的細胞凋亡，被視為一種新的耐藥相關基因〔5〕。研究發現，在Bcl-2過度表達的細胞，藥物仍能進入細胞內，誘導細胞損傷，但這種損傷不能有效地轉換成凋亡信號，從而使腫瘤細胞的生理性凋亡受抑制，增加了腫瘤細胞的生存時間，以致在化療期間表達Bcl-2的腫瘤細胞能以較快的速率重新生長，造成細胞過多堆積，從而參與了耐藥的發生〔6〕。

本實驗提示Bcl-2作為抗凋亡Bcl-2家族中的重要一員，其在DDP誘導的EC9706凋亡中起抑制作用。因此，Bcl-2的表達上調可能是EC9706細胞對DDP耐藥的重要機制，Bcl-2可作為食管癌基因治療的靶點，通過各種途徑抑制Bcl-2基因的表達從而促進腫瘤細胞凋亡，減少耐藥將為本課題后續研究重點。

4參考文獻

1Hong J，Peng DF，Chen Z，etal.ABL regulation by AXL promotes cisplatin resistance in esophageal cancer〔J〕.Cancer Res，2013；73(1)：331-40.

2Martinou JC，Youle RJ.Mitochondria in apoptosis：Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics〔J〕.Dev Cell，2011；21(1)：92-101.

3Tsujimoto Y，Finger LR，Yunis J，etal.Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t (14；18) chromosome translocation〔J〕.Science，1984；226(4678)：1097-9.

4Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis〔J〕.Mol Cell Biochem，2011；351(1-2)：41-58.

5Kelly PN，Strasser A.The role of Bcl-2 and its pro-survival relatives in tumourigenesis and cancer therapy〔J〕.Cell Death Differ，2011；18(9)：1414-24.

6Llambi F，Green DR.Apoptosis and oncogenesis：give and take in the BCL-2 family〔J〕.Curr Opin Gene Dev，2011；21(1)：12-20.

〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R735.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0562-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.020