針刺對大鼠心肌組織細胞因子的影響

治丁銘　劉　巖　趙鴻飛　李　凡　張　朕　張　卓

(長春中醫藥大學，吉林　長春　130117)

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針刺對大鼠心肌組織細胞因子的影響

治丁銘劉巖趙鴻飛1李凡2張朕張卓3

(長春中醫藥大學，吉林長春130117)

摘要〔〕目的探討針刺腎俞、心俞、內關穴治療慢性心力衰竭(CHF)的機制。方法將30只雄性Wistar大鼠分為對照組、卡托普利治療組(25 mg/kg,1次/d)、針刺治療組(針刺腎俞、心俞、內關穴，30 min/d)。復制CHF模型，2 w后，取大鼠心臟左室組織，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、SP法檢測大鼠心肌TNF-α、免疫組化SABC法檢測大鼠心肌白細胞介素(IL)-6表達水平，同時觀察大鼠心肌組織形態學改變。結果卡托普利治療組、針刺組心肌中TNF-α、IL-6水平低于對照組(P<0.05或P<0.01)；卡托普利治療組和針刺組TNF-α、IL-6水平無統計學意義(P>0.05)。結論針刺和卡托普利治療均可通過降低炎癥細胞因子改善心室重塑，而針刺治療與卡托普利治療效果無顯著差異，可一定程度替代或作為西藥治療的有益補充，神經體液調節可能是其發揮治療作用的機制。

關鍵詞〔〕針刺；慢性心力衰竭；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6

1吉林省中醫藥管理局2吉林省人民醫院骨科

3柳河縣衛生和計劃生育局

第一作者：治丁銘(1983-)，女，碩士，講師，主要從事心血管疾病文獻與臨證治療研究。

各種病因引起的心肌細胞損傷將會導致心室重塑。持續不斷的心室重塑最終發展至心力衰竭〔1〕。Blankesteijn等〔2〕研究發現急性心肌梗死12 h出現免疫炎癥反應，其在心力衰竭的發生中發揮重要作用。有研究證實，針刺俞穴可減少心肌缺血再灌注的損傷，對免疫系統和心血管系統有良好的調節作用〔3〕。本實驗從免疫和炎癥的角度，對試驗動物心肌組織腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6水平進行監測，初步探討針刺對慢性心力衰竭(CHF)大鼠治療的機制。

1材料

1.1動物健康SPF級，Wistar雄性大鼠30只，體質量200～250 g，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供。

1.2試劑和藥物大鼠(IL)-6免疫組化試劑盒購于上海彩佑實業有限公司；大鼠TNF-α酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購于上海嵐派生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒(博士德公司，武漢)；羊抗大鼠TNF-α多抗(R&D，美國)；卡托普利(12.5 mg，批號：H31022986)，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產；小動物呼吸機RWD407(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；OLYMPUS生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3方法

1.3.1CHF模型復制30只雄性Wistar大鼠，隨機分為3組，每組10只1籠，標記后飼養在恒溫、恒濕的飼養室內，標準飼料和純凈水供其隨機取食。大鼠適應性喂養1 w后進行模型復制。心衰大鼠模型采用冠狀動脈結扎法。首先將Wistar大鼠腹腔麻醉，背部固定，行氣管插管，以小動物呼吸機行正壓呼吸，在胸部4～5肋間開胸，暴露心臟，在距主動脈根部5 mm處(肺動脈圓錐和左心耳)之間結扎冠狀動脈左前降支，建立心衰模型，結扎后心室壁顏色變暗,心電圖檢查顯示ST段抬高伴肢體導聯R波高尖,即為結扎成功。建模成功后，腹腔注射青霉素40萬U/只以預防感染。用心導管和超聲心動圖確認CHF模型復制成功后開始治療。

1.3.2治療方法

1.3.2.1針刺依據華氏等研制的大鼠穴位圖譜作為大鼠穴位選擇的標準，選取大鼠內關穴、心俞穴、腎俞穴進行針刺，針刺采用30號1寸毫針，手法采用捻轉瀉法，捻轉幅度為3～4圈，捻轉頻率為3～4個/s往復，每次行針10～15，留針20～30 min，留針期間行針2～4次，每天治療1次。

1.3.2.2給藥卡托普利按體質量折算(25 mg/kg)灌胃給藥，每天灌服1次，連續治療2 w。對照組只復制模型，不進行治療。

1.3.3動物處理治療2 w后將Wistar大鼠稱重，然后用1%戊巴比妥鈉按30 mg/kg的劑量腹腔注射進行麻醉，麻醉后迅速摘取大鼠心臟組織并分別進行標本處理。

1.3.4TNF-α檢測血液TNF-α：抽取大鼠下腔靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，分離上清液。用ELISA法來測定大鼠血清TNF-α的濃度。心肌組織TNF-α：采用羊抗大鼠TNF-α多抗，采用SP法進行檢測，棕色和黃色顆粒代表陽性反應部位。

1.3.5IL-6檢測采用免疫組化SABC 法(按說明書操作)后用BH-2型OLYMPUS生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)觀察,并使用BI-2000微循環和醫學圖像分析系統進行測量。在400倍顯微鏡下,每組觀察10張切片,每張切片隨機選取10個不連續的視野計算出單位視野中的IL-6免疫陽性細胞個數(即數密度)及免疫陽性細胞所占單位視野中的陽性反應總面積(即面密度)。

1.4統計學方法采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2結果

2.1三組TNF-α水平比較與對照組〔(38.20±2.11)ng/ml〕相比，針刺組、卡托普利組血清TNF-α〔(34.37±2.75)ng/ml，(35.07±2.59)ng/ml〕顯著下降(P<0.05或P<0.01)。心肌組織免疫組化染色顯示，對照組TNF-α蛋白呈陽性染色，針刺組和卡托普利組蛋白染色較對照組弱。

2.2三組IL-6水平比較顯微鏡觀察結果顯示,三組大鼠的心肌細胞中均可見IL-6免疫陽性細胞的存在,心肌細胞胞質中都含有特異性的棕黃色陽性反應顆粒。組間數密度比較，對照組(4.68±0.23)高于針刺組和卡托普利組〔(4.12±0.32)，(4.26±0.37)〕(P<0.05或P<0.01)，而針刺組和卡托普利組無顯著差異(P>0.05)；組間面密度比較,對照組(10.41±0.62)高于卡托普利組(9.35±0.28)和針刺組(9.10±0.61)(P<0.01),而針刺組和卡托普利組之間差異不顯著。

2.3心肌顯微結構改變光鏡下見對照組心肌細胞排列紊亂，局灶性壞死，纖維化，間質增生，瘢痕形成，殘余部分心肌細胞肥大。針刺組及卡托普利組大鼠心肌組織改變情況較對照組有不同程度的改善。

3討論

心力衰竭是臨床常見的病理狀態，為多心血管病的末期表現之一，可分為急性或CHF，左心、右心或全心衰竭。近年來，國內外的學者開始關注細胞因子在CHF發病中的作用，越來越多的臨床和基礎試驗表明，細胞因子在CHF發病中發揮著重要的作用。TNF-α是由激活的巨噬細胞分泌的炎性因子，具有多種生物學效應，心力衰竭時血清TNF-α可見升高。Levine等〔4,5〕先后發現輕中度心力衰竭患者TNF-α即開始升高，惡病質患者血中TNF-α水平可見升高，且TNF-α升高與心功能分級和死亡率呈正相關。Kitaoka 等〔6〕觀察發現心力衰竭患者的TNF-α等血清表達水平與心力衰竭程度呈正相關，Yokoyama等〔7〕發現，TNF-α能加速心肌細胞蛋白質的合成，并能減慢心肌細胞蛋白質分解，使肌動蛋白合成數量，同時TNF-α還能改變細胞外基質，導致心肌肥厚。

IL-6是主要血管內皮細胞和單核巨噬細胞生成的主要炎癥反應性介質，可參與、可介導許多疾病的發生和發展。Feldman等〔8〕研究發現，IL-6和功能不全、心肌肥厚、肺水腫等心力衰竭的臨床癥狀有關。Bryant等〔9〕研究發現，IL-6能刺激心肌成纖維細胞快速增生,促進心肌蛋白質加速分解,誘導心肌細胞凋亡而損害心功能。TNF-α、IL-6可長期影響心肌重塑，參與CHF的病理生理過程。通過治療TNF-α、IL-6等細胞因子的變化可推測治療方法可能的作用機制。

本研究提示心力衰竭時心臟本身是合成釋放TNF-α和IL-6 的重要來源之一。心臟合成釋放TNF-α和IL-6再反過來作用于心臟，再次引發或加重心力衰竭。這也說明，炎癥因子在CHF發生發展中發揮著重要的作用。

在中醫上，CHF屬于“胸痹”、“心痛”、“心悸”等范疇。心氣不足、胸陽不振、血行閉阻等是常見中醫學病因，針灸可調整臟腑功能，疏通經脈、振奮陽氣，符合CHF治療益心氣、振心陽、通心脈的治療原則。李子勇等〔10〕研究顯示，針刺能改善CHF患者的血流動力學參數，降低氨基末端腦鈉肽前體(NT-pro-BNP)水平，降低急性生理與慢性健康狀況(APACHEⅡ)評分。 心俞是心的背俞穴，具有調理氣血、養心安神、寧心定志之功效，為歷代中醫名家治心胸病癥之要穴。對急性心肌缺血大鼠模型研究顯示，針刺心俞可影響血流動力學參數及改善心臟活動性質，針刺心俞及配穴后可使心肌張力降低，促進心肌肥大的退縮〔10〕。內關穴是手厥陰心包經之絡穴，同時是八脈交會穴之一。有寬胸理氣、寧心安神、調補陰陽氣血、緩急止痛、疏通經脈的功效。腎俞穴具有宣肺通氣、疏調上焦之效，是肺的背俞穴。針刺腎俞穴能改善肺功能，增加肺通氣量，中醫上，肺與心關系密切，肺主氣，心主血，那么肺與心的關系即為氣血關系，所以腎俞也用于與氣血關系最為相關的心血管系統疾病。

參考文獻4

1王愛民,王立君.心室重塑的研究進展〔J〕.疑難病雜志，2008;7(2)：123-5.

2Blankesteijn WM,Creemers E,Lutgens E,etal.Dynamic of cardiac wound healing following myocardial infarction:observation in genetically altered mice〔J〕.Acta Physiol Scand,2001;173(1):75-82.

3呂君玲,李佰承,冷俊艷，等.針刺治療心肌缺血研究進展與思路〔J〕.四川中醫，2014;32(6)：182-5.

4Levine B,Kalman J,Mayer A,etal.Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure〔J〕.N Engl J Med,1990;323(4):236-41.

5Torre-Amione G,Kapadia S,Benedict C,etal.Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction:a report from the studies of left ventricular dysfunction(SOLVD)〔J〕.J Am Coll Cardiol,1996;27(5):1201-6.

6Kitaoka H，Kubo T，Okawa M. Plasma adiponectin levels and left ventricular remodeling in hypertrophic cardiomyopathy〔J〕.Int Heart J，2010;51:51.

7Yokoyama T，Nakano M，Bendnarczyk JL，etal.Tumor necrosis factor-α provokes ahypertrophic growth response in adult cardiac myocytes〔J〕.Circulation，1997;95(5):1247-52.

8Feldman AM,Combed A,Wagnet D,etal.The role of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure〔J〕.J Am Coll Cardiol,2000;35:537-44.

9Bryant D,Backer L,Richardson J,etal.Cardiac failure intransgenic mice with myocardial expression of tumor necrosis factor-α〔J〕.Circulation,1998;97:1375-81.

10李子勇，老錦雄，潘清潔.針刺對慢性心力衰竭患者血流動力學及心功能的影響〔J〕.上海針灸雜志，2012;7：480-2.

〔2015-06-24修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

通訊作者：張卓(1976-)，女，副教授，主要從事神經系統疾病的診斷研究。

基金項目：吉林省中醫藥管理局科技項目(No.2014-J11;No.2014-2C4)

中圖分類號〔〕R541.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0019-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.008