自發性高血壓大鼠腦出血后炎癥反應與Th17細胞的相關性

張明石　李曉飛　李明軍　畢　勝　王德超

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科，黑龍江　佳木斯　154002)

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自發性高血壓大鼠腦出血后炎癥反應與Th17細胞的相關性

張明石李曉飛李明軍畢勝1王德超2

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科，黑龍江佳木斯154002)

目的探討自發性高血壓大鼠(SHR)腦出血后炎癥反應與Th17細胞的相關性。方法SHR隨機分為正常對照組，假手術組和模型組各5只。膠原酶大腦尾狀核注射制備大鼠自發性高血壓腦出血(HICH)模型。出血后48 h，冰上取腦。流式細胞儀檢測腦組織中Th17細胞占CD4+T細胞的百分比；酶聯免疫吸附(ELISA)方法檢測腦組織上清中白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。結果與正常對照組和假手術組相比，模型組腦組織中Th17細胞數量明顯增加，同時IL-6和TNF-α分泌水平明顯升高。結論腦出血急性期炎癥反應的誘導和發生與Th17細胞的參與密切相關，Th17細胞促進了腦出血后的病理進程；可能部分通過誘導炎性細胞因子IL-6和TNF-α分泌增加實現的。

自發性高血壓；腦出血；炎癥反應；Th17

在世界范圍內，腦卒中是一組發病率、致殘率和死亡率均很高的疾病，而高血壓腦出血(HICH)的病死率和致殘率則居各型腦卒中之首〔1〕，30 d病死率高達38%～52%。腦出血誘發的腦損傷中，四分之一屬于炎性反應及補體系統參與的免疫損傷〔2〕。炎癥反應(炎性細胞和炎癥介質)與繼發性腦組織損害密切相關。Th17細胞是新發現的與 Th1、Th2細胞完全不同的CD4+T細胞系，具有獨立的分化和調節機制〔3〕。Th17可分泌白細胞介素(IL)-17、IL-21和 IL-22等，在促炎反應和自身免疫病中發揮重要作用。本文觀察高血壓大鼠腦出血后Th17細胞數量變化特點，直觀反映Th17在HICH腦損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料健康自發性高血壓大鼠(SHR)，體重250～300 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物中心提供(合格證：SCKX(京)2002-0003)。適應性喂養2 w，隨機分為正常對照組、假手術組、模型組各5只。主要試劑有抗CD3-PE單抗、抗CD4-FITC單抗(GK1.5克隆)、抗IL-17A-APC單抗和抗FcγⅢ/Ⅱ受體抗體(2.4G2克隆)：BD Pharmigen公司(美國)；抗IL-17A mAb：Biolegend公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒：R&D 公司(美國)(MN)；IL-6 ELISA試劑盒：R&D 公司(美國)(MN)；Ⅶ型膠原酶：Sigma公司(美國)。主要儀器有流式細胞儀，BD Aria，美國；酶標檢測儀，MoH 99-15，芬蘭LM。

1.2模型制作參照徐雅〔4〕的方法：麻醉大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mg/kg)，將大鼠固定于腦立體定位儀并且暴露顱骨〔5〕，鉆開顱骨，將0.5 μl膠原酶(含有膠原酶0.5 mg)通過微量注射器垂直注入大鼠腦組織尾狀核部位。觀察5 min后取出微量注射器縫合。正常組無任何操作，假手術組以等體積的生理鹽水進行尾狀核注射。

1.3動物處理大鼠出血48 h后斷頸，取出全部腦組織并迅速切取尾狀核注射針孔前后2 mm腦組織，全部操作需冰上進行。一部分加入適量的3%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)迅速制備單細胞懸液，用于流式檢測；另一部分加入預冷生理鹽水(0.25 ml/100 mg腦重)迅速勻漿，低溫14 000 r/min，離心15 min。取上清-80℃保存，用于細胞因子檢測。

1.4流式細胞儀檢測CD3+CD4+IL-17+T細胞數量制備腦細胞懸液，CD3-FITC、CD4-PE和IL-17A-APC 三色同時標記，設陰性對照管。取新鮮制備的1×106個腦單細胞懸液加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體預處理的流式專用管，隨后加入FITC-抗CD3和PE-抗CD4熒光抗體表面染色，3%胎牛血清(FCS)洗2次，加入固定透膜劑孵育30 min，再加入APC-抗IL-17A 熒光抗體細胞內染色。同時同型對照抗體(FITC)大鼠IgG2b染色。應用FACSCELLQUEST 軟件，記錄Th17占CD4+T細胞的百分率。

1.5細胞因子檢測檢測血清中IL-6和TNF-α水平變化，并計算細胞因子含量。可選用雙抗體夾心ELISA試劑盒，檢測結果以試劑盒提供的標準品繪制，應用Soft Max Pro 4.3.1LS軟件分析，標準曲線酶標儀測定450 nm處OD值。

1.6統計學方法應用SPSS11.5統計軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1腦出血48 h后腦組織中Th17細胞數量的變化與正常對照組(0.37%±0.24%)相比，模型組腦組織中CD3+CD4+IL-17+T細胞數量(3.83%±0.43%)明顯增加(P<0.01)；與假手術組(0.71%±0.37%)相比也明顯增加(P<0.01)。

2.2腦出血48 h后腦組織中IL-6水平的變化與正常對照組〔(3.71±0.38)pg/ml〕相比，假手術組〔(6.37±0.65)pg/ml〕和模型組腦組織中IL-6水平〔(13.16±0.78)pg/ml〕均明顯升高(P<0.01)；與假手術組相比，模型組腦組織中IL-6水平也明顯升高(P<0.01)。

2.3腦出血48 h后腦組織中TNF-α水平的變化與正常對照組〔(3.77±0.39)pg/ml〕相比，模型組腦組織中TNF-α水平〔(7.81±0.85)pg/ml〕明顯升高(P<0.01)；與假手術組〔(4.01±1.00)pg/ml〕相比，模型組腦組織TNF-α水平也明顯升高(P<0.05)。

3　討　論

炎癥是一種常見的病理現象，腦出血后血腫及其血腫本身的機械壓迫是引發周圍組織炎性反應的重要因素。然而炎癥反應又是引發繼發性腦損傷的必要條件〔2〕。炎性反應一方面可以幫助宿主清除和吸收壞死組織和細胞碎片，修復損傷，是機體正常防御性反應。但其也有不利的一面，即炎性反應過程中會導致多種酶/炎癥介質的釋放，誘導腦組織周圍水腫及神經細胞損傷加重〔6〕。

多位學者研究證實，HICH后在血腫內及血腫周圍有炎癥反應發生，白細胞的浸潤和小膠質細胞的活化誘導了IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的釋放，并在48 h達高峰，且能持續1 w〔7〕。IL-6的主要細胞來源包括T、B淋巴細胞、單核細胞和內皮細胞，對于腦組織，星形細胞和小膠質細胞則是IL-6的主要來源，參與HICH后的免疫應答和炎癥反應并發揮重要作用，是腦損傷程度及預后的重要監測指標〔8〕。TNF是促炎性細胞因子，單核-巨噬細胞是TNF-α的主要來源。神經細胞、星形細胞和小膠質細胞是中樞神經系統中TNF-α的主要來源，其主要生物學功能包括殺傷腫瘤，調節機體炎癥反應及免疫應答。

Th17 細胞是有別于Th1 和Th2 細胞的一種新的CD4+T細胞亞群。Th17分泌的細胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-6和TNF-α等細胞因子，因此Th17細胞被認為是一群介導炎癥反應的重要細胞〔9〕。對于Th17細胞的作用機制，通常認為它可以通過誘導其他炎癥細胞因子如IL-6，TNF-α及趨化因子如單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-2等的表達，介導炎癥細胞到達病變局部，造成組織損傷〔10〕。本研究提示，Th17細胞參與了腦出血急性期炎癥反應的誘導和發生，促進了腦出血后的病理進程。可能部分通過誘導炎性細胞因子IL-6和TNF-α分泌增加實現的。但Th17細胞在腦出血發病中的作用機制尚需進一步研究。

1中華神經科學會.各類腦血管疾病診斷要點〔J〕.中華神經科雜志，1996；291(6)：379-82.

2Gong C，Hoff JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Brain Res，2000；871(1)：57-65.

3Littman DR，Rudensky AY.Th17 and regulatory T cell in mediating andrestraining inflammation〔J〕.Cell，2010；140(6)：845-58.

4徐雅.安工清開靈干預自發性高血壓大鼠腦出血模型炎癥反應的機制研究〔D〕.北京：北京中醫藥大學，2007.

5Arvin B，Neville LF，Barone FC，etal.Brain injury and inflammation：a putative role of TNF alpha〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1995；765：62-71.

6Del Zoppo GJ，Becker KJ，Hallenbeck JM.Inflammation after stroke〔J〕.Arch Neurol，2001；58(4)：669-72.

7張祥建，李春巖，劉春燕，等.炎癥反應與大鼠腦出血后腦損傷的相關性〔J〕.中華神經科雜志，2005；38(6)：396-7.

8Fassbender K，Rossol S，Kammer T，etal.Proinflammtory cytokines in serum of patients with acute cerebral ischemia：kinetics of serection and relation to the extent of brain damage and outcome of disease〔J〕.J Neurol Sci，1994；122(2)：135-9.

9Nurieva R，Yang XO，Martinez G，etal.Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation of inflammatory T cells〔J〕.Nature，2007；448：480-3.

10Kolls JK，Linden A.Interleukin-17 family members and inflammation〔J〕.Immunity，2004；21：467-76.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

黑龍江省自然科學基金(No.B2015013)

畢勝(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事神經免疫學研究。

張明石(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經外科學研究。

R743.34

A

1005-9202(2016)17-4146-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.004

1佳木斯大學附屬第一醫院神經內科2佳木斯大學研究生學院