胃癌患者CD4+/8+ T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表達水平及意義

馮　吉

(杭州市下沙醫院普外科，浙江　杭州　310000)

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胃癌患者CD4+/8+T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表達水平及意義

馮吉

(杭州市下沙醫院普外科，浙江杭州310000)

目的觀察胃癌患者外周血、癌旁組織和癌組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞表面T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3)的表達情況及其對CD4+T細胞和CD8+T細胞功能的影響。方法抽取胃癌患者外周血，通過密度梯度離心法分選獲取外周血單個核細胞(PBMC)。獲取的腫瘤組織及癌旁組織標本經研磨法獲取腫瘤浸潤T細胞。通過流式細胞染色的方法檢測胃癌患者外周血、癌旁組織和癌組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞表面Tim3的表達情況。激活Tim3信號后，通過流式細胞術胞內染色的方法檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞表達腫瘤壞死因子(TNF)-α和穿孔素的能力。結果與胃癌患者外周血CD4+/8+T細胞表面Tim3表達水平相比，胃癌患者癌旁組織和癌組織浸潤CD4+/8+T細胞表面Tim3表達水平顯著升高(P<0.01)；且與胃癌患者癌旁組織浸潤CD4+/8+T細胞表面Tim3表達水平相比，胃癌患者癌組織浸潤CD4+/8+T細胞表面Tim3表達水平顯著升高(P<0.01)。激活Tim3信號后，CD4+T細胞分泌TNF-α的能力顯著降低(P<0.01)，同時CD8+T細胞分泌穿孔素的能力亦顯著降低(P<0.01)。結論胃癌組織CD4+T細胞和CD8+T細胞表面Tim3表達水平的升高可能與胃癌的進展密切相關。

胃癌；T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3

胃癌患者的免疫系統處于免疫抑制狀態。與CD4+/CD8+T細胞功能抑制相關的分子包括程序性死亡分子(PD-1)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3)等〔1～3〕。關于胃癌患者CD4+/CD8+T細胞表面PD-1分子的表達及功能已有文獻報道〔4〕，而關于Tim3在胃癌患者CD4+/CD8+T細胞表面的表達及功能還未見文獻報道。研究胃癌患者外周血、癌旁組織和癌組織中CD4+/CD8+T細胞表面Tim3的表達情況及其對CD4+T細胞和CD8+T細胞功能的影響，有利于揭示胃癌患者的免疫抑制機制，干擾CD4+/CD8+T細胞的免疫抑制狀態，可能成為治療胃癌的新靶點。

1　材料與方法

1.1臨床資料選取2014 年10月30日至2015年9月30日在我科住院并行手術治療的胃癌患者20例。患者術前均未接受化學治療、放射治療或免疫治療，收集患者癌組織標本，同時收集20例患者癌旁組織標本作為對照。組織標本離體后10 min 內凍存于液氮中保存。每例樣本均經過組織病理學診斷證實為胃癌。20例患者的平均年齡為(53.12±11.35)歲。

1.2外周血單個核細胞(PBMC)獲取無菌抽取患者外周血，以無菌PBS稀釋1倍。稀釋血液加入預先加有淋巴細胞分離液(稀釋血液∶淋巴細胞分離液為2∶1)的離心管中，1 800 r/min離心20 min。吸取中間白色的淋巴細胞白膜層，加入預裝10 ml PBS的離心管中，1 500 r/min離心15 min。棄盡PBS，以10 ml PBS重懸細胞沉淀，1 200 r/min離心8 min。獲取的細胞即為PBMC，可用于后續實驗。

1.3Tim3染色方法上述分離獲取的PBMC以1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，每次5 min。棄盡上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS。隨后加入相應的抗體(CD3、CD4、CD8和Tim3)。4℃孵育30 min。以1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，每次5 min。棄盡上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS后進行流式細胞檢測。

1.4胞內染色方法細胞預先以適量的PMA和Ion于37℃預處理6 h。收取細胞后以1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，按1.3方法先進行CD3、CD4和CD8染色。染色結束后細胞以透化液洗滌2次，加入腫瘤壞死因子(TNF)-α和穿孔素抗體。室溫避光孵育30 min。以透化液洗滌2次。棄盡上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS后進行流式細胞檢測。

1.5統計學方法采用GraphPad軟件，兩組數據比較采用t檢驗，多組數據比較采用ANOVA分析。

2　結　果

2.1外周血、癌旁組織和胃癌組織中CD4+T細胞Tim3表達胃癌患者外周血CD4+T細胞表面Tim3表達陽性百分比為(2.29±1.44)%；癌旁組織CD4+T細胞表面Tim3表達陽性百分比為(6.16±3.37)%；癌組織中表達陽性百分比為(24.11±6.37)%，組間比較差異顯著(P<0.01)。

2.2外周血、癌旁組織和胃癌組織中CD8+T細胞Tim3表達胃癌患者外周血CD8+T細胞表面Tim3表達陽性百分比為(2.69±1.36)%；癌旁組織為(8.05±3.52)%；胃癌患者癌組織浸潤CD8+T細胞表面Tim3表達陽性百分比為(33.73±7.63)%，組間比較差異顯著(P<0.01)。

2.3Tim3對CD4+T細胞分泌細胞因子能力的影響對照組CD4+TNF-α+細胞百分比為(33.93±6.31)%，激活Tim3信號通路后CD4+TNF-α+細胞百分比為(20.41±4.47)%。Tim3可顯著抑制CD4+T細胞TNF-α分泌能力(P<0.01)。

2.4Tim3對CD8+T細胞殺傷能力的影響對照組CD8+Perforin+細胞百分比為(36.35±7.73)%，激活Tim3信號通路后CD8+Perforin+細胞百分比為(21.38±5.03)%。Tim3可顯著抑制CD8+T細胞的殺傷能力(P<0.01)。

3　討　論

Tim家族成員主要包括Tim1、Tim3和Tim4〔5〕。Tim3是一種負性調節分子，主要表達于分化成熟的Th1型細胞表面〔6〕。現在，Tim3、細胞毒性淋巴細胞相關抗原(CTLA)-4及程序性死亡分子(PD)-1都被歸類于免疫系統抑制受體家族〔6,7〕。大量研究顯示Tim3在多種腫瘤組織中的表達與腫瘤的進展密切相關〔8,9〕。

除外與腫瘤的發生和發展密切相關，Tim3已知和T細胞耗竭密切相關〔10〕。文獻研究顯示，在多種腫瘤組織浸潤的CD4+/CD8+T細胞表面Tim3的表達水平均出現顯著升高〔4〕。結果提示，Tim3可能參與了胃癌發生發展過程中CD4+/CD8+T細胞功能的耗竭，從而促進了胃癌的發生和發展。為了進一步明確胃癌患者中CD4+/CD8+T細胞表面過表達的Tim3和CD4+/CD8+T細胞功能的關系，本研究采用活化抗體激活CD4+/CD8+T細胞表面表達的Tim3。結果提示，Tim3可顯著抑制CD4+T細胞的細胞因子分泌能力和CD8+T細胞的殺傷功能。

綜上述所，本研究結果初步證實胃癌患者癌組織浸潤CD4+/CD8+T細胞表面Tim3表達水平顯著升高，且升高的Tim3可抑制CD4+/CD8+T細胞的功能，提示胃癌組織CD4+T細胞和CD8+T細胞表面Tim3表達水平升高可能與胃癌進展密切相關。

1Hassan SS,Akram M,King EC,etal.PD-1,PD-L1 and PD-L2 gene expression on T-cells and natural killer cells declines in conjunction with a reduction in PD-1 protein during the intensive phase of tuberculosis treatment〔J〕.PLoS One,2015;10(9):e0137646.

2Park HJ,Park JS,Jeong YH,etal.Correction:PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells〔J〕.J Immunol,2015;195(12):5841-2.

3Ngiow SF,von Scheidt B,Akiba H,etal.Anti-TIM3 antibody promotes T cell IFN-γ-mediated antitumor immunity and suppresses established tumors〔J〕.Cancer Res,2011;71(10):3540-51.

4Arai Y,Saito H,Ikeguchi M.Upregulation of TIM-3 and PD-1 on CD4+ and CD8+ T cells associated with dysfunction of cell-mediated immunity after colorectal cancer operation〔J〕.Yonago Acta Med,2011;55(1):1-9.

5Shakhov AN,Rybtsov S,Tumanov AV,etal.SMUCKLER/TIM4 is a distinct member of TIM family expressed by stromal cells of secondary lymphoid tissues and associated with lymphotoxin signaling〔J〕.Eur J Immunol,2004;34(2):494-503.

6Markwick LJ,Riva A,Ryan JM,etal.Blockade of PD1 and TIM3 restores innate and adaptive immunity in patients with acute alcoholic hepatitis〔J〕.Gastroenterology,2015;148(3):590-602.

7Ma Y,Liu X,Zhu J,etal.Polymorphisms of co-inhibitory molecules(CTLA-4/PD-1/PD-L1) and the risk of non-small cell lung cancer in a Chinese population〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(9):16585-91.

8Li Z,Li N,Zhu Q,etal.Genetic variations of PD1 and TIM3 are differentially and interactively associated with the development of cirrhosis and HCC in patients with chronic HBV infection〔J〕.Infect Genet Evol,2013;14:240-6.

9Ngiow SF,Teng MW,Smyth MJ.Prospects for TIM3-targeted antitumor immunotherapy〔J〕.Cancer Res,2011;71(21):6567-71.

10Jayaraman P,Sada-Ovalle I,Beladi S,etal.Tim3 binding to galectin-9 stimulates antimicrobial immunity〔J〕.J Exp Med,2010;207(11):2343-54.

〔2015-11-15修回〕

(編輯徐杰)

馮吉(1981-)，男，碩士，住院醫師，主要從事胃腸乳腺甲狀腺腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)16-3883-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.006