菊花病毒脫除及其檢測技術研究進展

郭倩楠，張文芳，賈小玉，殷 瑩，閆文懿，崔智慧，趙喜亭，2，3*

（1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007；2.河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術研究中心，河南新鄉 453007；3.河南省綠色藥材生物技術工程實驗室，河南新鄉 453007）

菊花病毒脫除及其檢測技術研究進展

郭倩楠1，張文芳1，賈小玉1，殷 瑩1，閆文懿1，崔智慧1，趙喜亭1，2，3*

（1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007；2.河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術研究中心，河南新鄉 453007；3.河南省綠色藥材生物技術工程實驗室，河南新鄉 453007）

介紹感染菊花的2種主要優勢病毒菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV），從光合作用、N代謝水平及抗膜脂過氧化能力3個方面探討了病毒病對菊花產量和品質的影響，同時對菊花病毒的脫除及檢測技術進行了比較概述，認為超低溫療法在菊花病毒的脫除中具有良好的發展前景，芯片技術是菊花病毒快速檢測技術的重要發展方向。

菊花；病毒；脫毒技術；檢測技術

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）為菊科菊屬多年生草本植物，中國十大名花之一，集觀賞、食用、藥用、茶飲為一體，具有重要經濟價值。生產上主要采用扦插、分株、嫁接等繁殖方法，但營養繁殖易感染病毒病，對菊花質量影響較大。然而防治菊花病毒病還沒有特效藥，目前采用病毒脫除技術獲得無毒苗。菊花脫毒技術主要有莖尖培養及結合熱處理、超低溫療法。檢測技術主要有指示植物法、電鏡觀察法、酶聯免疫吸附法（ELISA）、分子生物學（單一RT-PCR、多重RTPCR、實時熒光定量PCR、熒光環介導逆轉錄等溫擴增RT-LAMP）技術。

1 病毒病對菊花的為害

1.1 侵染菊花的主要病毒

世界范圍感染菊花的病毒已有20多種［1］，在我國主要有菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯X病毒（Potato virus X）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）、番茄斑萎病毒（TSWV）、菊花矮化類病毒（CSVD）等8種［2-3］。CVB和TAV是感染菊花的優勢病毒［4-5］，能感染包括墨菊、懷菊、瓜葉菊、野菊、金魚草、金盞菊、翠菊、蠟菊及羅納菊等多種菊花［6］。TAV在1949年于馬鈴薯中首次被發現［7］，為RNA病毒，屬于雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬，通過汁液和蚜蟲非持久式傳播，造成菊花植株矮化、花變形、無葉片及生殖能力喪失等［8］。CVB于1952年被鑒定出是單鏈正義RNA病毒，屬于線性病毒科香石竹潛隱病毒屬，通過插條和汁液進行傳播，使感染的菊花葉呈斑駁狀或壞死斑［8-9］。其在菊花上的鈍化溫度為70～80℃，稀釋終點為10-2～10-4［10］。

1.2 病毒病對菊花品質和產量的影響

菊花為世界“四大切花”之一，銷量居首。但常因受到病毒侵染而使其生理生化活動受到影響，進而造成菊花品質和產量大幅下降。病毒對菊花生理生化的影響主要表現在光合作用、N代謝水平及抗膜脂過氧化能力3個方面。

病毒感染菊花后葉綠體的結構和功能均受到損傷，光合能力下降。脫除CVB的杭白菊葉綠素含量、光合作用能力均明顯增加［11］。脫除TAV、PVY后，亳菊葉綠素含量明顯增加，且葉片較寬［12］。九月菊在脫毒后表現為植株粗壯、葉片寬等生長優勢［13］。

N代謝是植物重要的生理生化過程，衡量指標主要有硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）的活性、可溶性蛋白的含量及游離脯氨酸的含量。N代謝的正常進行能使植株免受硝酸鹽的毒害，進而長勢優良。小黃菊脫除TAV后，其游離脯氨酸含量及NR活性均提高，N代謝能力增強［2］。

植物感染病毒后膜脂過氧化程度加劇、保護酶活性降低、產量和品質大幅下降。與未脫除TAV病毒的小黃菊株系相比，脫除TAV后，丙二醛（MAD）、H2O2含量及O2·-生成速率均顯著降低，保護酶（超氧化物岐化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT、抗壞血酸過氧化物酶APX、硝酸還原酶GR）的活力均顯著增高，藥用成分綠原酸的含量增幅在7.6%～39.7%、木犀草苷的含量增幅在15.7%～62.6%［2］。懷白菊脫除TAV后，O2·-生成速率、MDA的含量降幅最大值超30%，APX活性升高幅度最高值也超50%，產量和品質均得到顯著改善［14］。綜上，病毒感染菊花引起光合作用下降、N代謝水平和抗膜脂過氧化能力降低，嚴重影響其產量和品質。

2 菊花脫毒技術的研究現狀

目前菊花病毒病大多采用農藥防治，而農藥的使用會造成土壤污染、農藥殘留以及病毒抗藥性增強的問題。病毒的抗藥性使農藥用量加大，形成惡性循環，而菊花病毒的脫除技術是一項傳統的綠色環保技術，能使菊花提純復壯，增強對病毒的抗性。有關菊花病毒的脫除技術主要有莖尖培養，以及結合熱處理和超低溫療法。

2.1 莖尖培養及其結合熱處理

莖尖培養是傳統的菊花脫毒技術之一。Morel等［15］于1952年對大麗菊的花葉病毒脫除中而建立。莖尖培養是利用植物莖尖含極少病毒或幾乎不含病毒（即免疫區）而進行的組織培養［16-17］。一般來說，莖尖越短，其病毒含量越少，脫毒效率越高，但植物的成活率降低，因而對于不同品種的菊花其莖尖的切取長度還需通過試驗來進行探究。當莖尖長度短于0.3 mm時，菊花品種寒小白CVB的脫毒效率高達66.7%，但成活率低至6%；而當莖尖長度為0.7～1.0 mm時，成活率最高（90%），但脫毒率最低（僅為6.67%）［18］；當莖尖長度為0.4～0.5 mm時，墨菊CMV、CVB、TMV脫毒率較好分別為61.9%、63.2%、55.0%，莖尖成活率為66.7%［19］。

雖然莖尖培養法成本低，無污染，但由于莖尖十分小，很難剝離，因此在操作技術上有很大困難。故而常采用莖尖結合熱處理來脫除菊花的病毒。

熱處理結合莖尖培養法利用熱處理能使植物頂端免疫區擴大，可切取較長的莖尖，因而操作難度得以降低，同時莖尖再生苗的成活率也大大增加。對墨菊分別進行莖尖培養、莖尖結合熱處理，脫除CVB的比率分別為63.2%和86.7%［19］。利用熱處理及莖尖結合熱處理對菊花TAV進行脫除，脫毒率分別為20%和60%［20］。以上說明，莖尖結合熱處理是一種較好的脫毒方法。

2.2 超低溫療法

超低溫療法是一種以超低溫保存（Cryopreservation）與植物組織培養相結合的新型植物脫毒技術。原理為：在低溫下，病毒所在的植物細胞液泡中水分含量高，易產生結晶殺死病毒，而分生組織胞質濃，抗凍性強，易存活［21］。該技術已應用于許多植物的病毒脫除中，如香蕉的CMV脫除率為30%［22］、葡萄的葡萄A病毒（GVA）的脫毒率為97%［23］、柑橘的黃龍病菌（HLB）的脫除率高達90.9%～94.3%［24］。在菊花上，低溫療法主要運用在種質資源的保存上，在脫毒方面的研究報道較少。但因該技術處理周期短且能很好地保持植物的遺傳穩定性，因而在菊花病毒的脫除中具有良好的發展前景。研究表明，運用該方法脫除非洲菊妃子CMV和TMV，脫除率為100%［25］。

3 菊花病毒檢測技術的研究現狀

將菊花進行脫毒再生后，檢測脫毒苗的脫毒狀況是必要的，因為病毒的檢測可以說明菊花的脫毒方法是否有效，從而為下一步工作打下基礎。檢測菊花病毒的技術主要有指示植物法、電鏡觀察法、酶聯免疫吸附法和分子生物學方法。

3.1 指示植物法

指示植物（生物學檢測法）是比較傳統，也是早期使用的一種檢測植物感染病毒與否的技術，是根據病毒能夠侵染特定的寄主并使寄主產生特定的癥狀類型而進行檢測的方法［26］。病毒侵染菊花后常出現花葉、條紋、斑駁、矮化、枯斑、畸形等明顯癥狀［27］。常用的方法包括汁液摩擦接種［28］和嫁接傳染［29］。

指示植物法操作簡單，且結果直觀，但在自然環境中，菊花常受到多種病毒侵染，因而很難根據指示植物的癥狀鑒定出病毒的確切種類。

3.2 電鏡觀察法

電鏡觀察法是在電子顯微鏡下觀察病毒粒子的大小及病毒外殼蛋白的形狀，從而鑒定出病毒的技術［30］。自Kausche等［31］首次在電鏡下看到TMV以來，電鏡已成為植物病毒研究必不可少的手段之一。因電子的穿透力低，所以常用超薄切片技術結合免疫電鏡才能鑒定出病毒。利用醋酸氧鈾負染，在電鏡下發現了TAV［32］。CMV的6個不同株系的區分利用了負染、超薄切片技術與電鏡技術相結合［33］。

電鏡法的優點是能夠準確且較靈敏的檢測菊花病毒，然而此方法需要先進的儀器設備，花費大，且須掌握準確的操作技術。

3.3酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（ELISA）是一種靈敏且能大量檢測植物病毒的技術。其原理為：將待測物加入到酶與抗體或抗原結合的復合物中，依據底物的顯色反應來判斷待測物是否有病毒及其種類［34］。目前應用最多的是雙抗體夾心法（DAS-ELISA）和A蛋白雙抗夾心法（PAS-ELISA）。經DAS-ELISA法，檢測出菊花的4個品種均感染CVB，其中1種還感染TAV［35］。利用DAS-ELISA法能鑒定出菊花的TAV［36］。此外，利用PAS-ELISA也檢測出杭白菊中含有菊花B病毒［11］。

酶聯免疫吸附法因靈敏度高、特異性強被廣泛使用在菊花病毒的檢測中，但該技術只能檢測1種病毒，且會出現假陰性。

3.4分子生物學法

分子生物學檢測法是通過檢測病毒核酸（DNA或RNA）來證實病毒的存在，主要包括核酸雜交技術、雙鏈RNA（dsRNA）電泳技術及反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）。在菊花上主要應用RT-PCR技術。

RT-PCR法比酶聯免疫吸附法更為靈敏，并能檢測多種菊花病毒的脫毒技術。其原理是以RNA為模板，反轉錄出cDNA，然后在體外經PCR擴增，根據電泳圖譜分析來檢測植物感染病毒與否［2］。隨著RT-PCR技術的發展，RT-PCR技術又分為單一RT-PCR、多重RT-PCR、實時熒光定量PCR及RT-LAMP技術。

3.4.1 單一RT-PCR

指利用一種病毒的引物，轉錄出cDNA后再用PCR擴增，從而檢測出病毒的技術。其特點是只能檢測1種病毒。懷菊花TAV病毒的檢測［2］及CVB的鑒定［1］就是利用此方法。

3.4.2 多重RT-PCR

指能在一個反應體系中加入多種病毒引物進行反轉錄，從而檢測多種病毒的檢測技術。因菊花在自然條件下常受到病毒的復合感染，所以該方法在現階段較為流行。利用二重RT-PCR能同時檢測出菊花的CVB和TAV［37］。利用四重RT-PCR能檢測菊花2種病毒（CVB和TVA），以及2種類病毒，CSVD和菊花枯黃斑點類病毒（CChMVd）［38］。目前該技術能一次檢測出菊花的5種病毒（TAV、CVB、CMV、TMV和PVY）及2種類病毒（CSVD，CChMVd）［39］。

3.4.3 實時熒光定量PCR

是一種利用熒光探針與PCR反應產物雜交后所產生的熒光量定量檢測植物病毒的技術。該技術既能避免假陽性的出現，也能定量檢測病毒。利用該方法可檢測至少50 fg的TSWV［40］。菊花病毒（CMV、TMV）和類病毒（PVY）的實時熒光定量PCR檢測技術體系已成功建立［41］。

3.4.4 RT-LAMP技術

是一種于21世紀初建立的新型檢測病毒的手段。在60～65℃等溫條件下，LAMP能在具有鏈置換活性的DNA聚合酶下識別目的基因6個區段的4條引物，進而擴增目的基因［42］。由于該技術能一次性快速地反轉錄和擴增RNA病毒，所以在菊花病毒檢測中得到快速發展。在菊花TSWV檢測中，RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高出100倍［43］。此外，在菊花TAV的檢測中也發現，RTLAMP比RT-PCR更靈敏［44］。目前已在單一RTLAMP技術上發展出多重RT-LAMP。Liu等［45］于2014年建立了菊花CVB和CSVD的二重RT-LAMP技術。

4 問題及展望

菊花品種不同，脫毒技術不盡相同。菊花品種繁多，遺傳背景復雜，加之長期的營養繁殖使病毒感染嚴重，同時大面積生產時，連作也會造成病毒富集而大量減產。因此，根據不同菊花品種建立更為有效的脫毒技術是研究的重要課題。國際上迅速發展的芯片技術，是將大量DNA探針片段有序地固化于支持物表面，與已標記的DNA分子雜交，再對雜交信號進行檢測分析，從而識別樣品中存在的特異性核酸序列［1］。此法是DNA雜交技術與熒光標記技術相結合的基因水平檢測技術，具有靈敏度高和可靠性強的特點，是菊花病毒快速檢測技術的重要發展方向［46］。

參考文獻：

［1］ 吳紅芝，陳海如.RT-PCR檢測菊花B病毒的研究［J］.西南農業大學學報，2002，24（2）：115-117.

［2］ 周穎媛.懷菊花脫毒快繁技術及脫毒苗大田適應性研究［D］.新鄉：河南師范大學，2014.

［3］ 吳紅芝，孔寶華，陳海如，等.昆明地區菊花病毒病的調查與鑒定［J］.云南農業大學學報，2002，17（1）：24-27.

［4］ 楊鵬輝，王仁睿，劉軍，等.菊花脫毒無害化技術研究進展［J］.陜西農業科學，2011，57（1）：89-92.

［5］ 吳紅芝，孔寶華，陳海如，等.侵染菊花番茄不孕病毒的鑒定及外殼蛋白基因的克隆［J］.中國病毒學，2002，17（2）：145-148.

［6］ 顏琛娜.菊花CVB，TAV和CChMVd病毒的RT-PCR檢測及匍匐小菊葉盤再生體系的建立［D］.南京：南京農業大學，2008.

［7］ BLENCOWE J，CALDWEL J.Aspermy-a new virus disease of the tomato［J］.Annals of Applied Biology，1949，36（3）：320-326.

［8］ 劉輝輝，沈學根，毛碧增.菊花病毒病及其防治對策［J］.藥物生物技術，2015（1）：21.

［9］ NOORDAM D.Virus diseases of Chrysanthemum indicum in the Netherlands［J］.Tijdschrift Over Plantenziekten，1952，58：121-190.

［10］ HAKKAART F A，MAAT D Z.Variation of Chrysanthemum virus B［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1974，80（3）：97-103.

［11］ 劉輝輝.杭白菊病毒病原鑒定及脫毒苗生物學性狀與品質性狀分析［D］.杭州：浙江大學，2015.

［12］ 代麗萍.毫菊脫毒技術研究及其品質測定［D］.合肥：安徽農業大學，2009.

［13］ 劉鵬，劉金，趙艷紅，等.菊花的組織培養，脫毒與快繁技術研究［J］.內蒙古民族大學學報（自然科學版），2005，20（4）：410-413.

［14］ 趙喜亭，田瑩，周穎媛，等.番茄不孕病毒（TVA）對‘懷白菊’活性氧化代謝的影響［J］.植物生理學報，2015，51（10）：1757-1763.

［15］ 尤燕平.菊花病毒鑒定及莖尖培養脫毒方法研究［D］.南京：南京農業大學，2012.

［16］ 徐啟江，陳典.莖尖分生組織培養在植物病毒防治中的應用［J］.生物學教學，2001，26（9）：4-5.

［17］ 許傳俊，黃珺梅，曾碧玉，等.植物組織培養脫毒技術研究進展［J］.安徽農業科學，2011，39（3）：1318-1320.

［18］ 尤燕平，彭詩怡，朱文瑩，等.莖尖培養法脫除菊花B病毒的研究［J］.南京農業大學學報，2013（5）：27.

［19］ 趙霜，李青，戴思蘭.不同方法脫除菊花體內3種病毒效果的研究［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2013，41（8）：168-174.

［20］ 宋瑞琳，韋曉霞，吳如健.切花菊的番茄不孕病毒脫除技術研究［J］.福建農業學報，1999（1）：23-27.

［21］ 王仁睿，王喬春，李明福，等.植物莖尖超低溫技術脫除病原體研究進展［J］.植物檢疫，2012，26（4）：65-69.

［22］ HELLIOT B，PANISB，POUMAY Y，et al.Cryopreservation for the elimination of cucumber mosaic and banana streak viruses from banana（Musa spp.）［J］.Plant Cell Reports，2002，20（12）：1117-1122.

［23］ WANG Q，MAWASSI M，LI P，et al.Elimination of grapevine virus A（GVA）by cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of Vitis vinifera L［J］.Plant Science，2003，165（2）：321-327.

［24］ DING F，JIN S，HONG N，et al.Vitrificationcryopreservation，an efficientmethod for eliminating candidatus liberobacter asiaticus，the citrus Huanglongbing pathogen，from in vitro adult shoot tips［J］.Plant Cell Reports，2008，27（2）：241-250.

［25］ 欒愛萍.非洲菊莖尖超低溫脫毒及病毒檢測技術［D］.長沙：湖南農業大學，2012.

［26］ 陳繼峰，趙軍營，李紹華.果樹病毒檢測方法及其應用［J］.河北林果研究，2005，20（2）：167-173.

［27］ 楊鵬輝.菊花品種“日本紅”的脫毒處理及健康檢測方法研究［D］.雅安：四川農業大學，2011.

［28］ 吳凌娟，張雅奎，董傳民，等.用指示植物分離鑒定馬鈴薯輕花葉病毒（PVX）的技術［J］.中國馬鈴薯，2003（2）：82-83.

［29］ 楊傳貴，田硯亭.蘋果潛隱病毒快速檢測［J］.北京林業大學學報，1997，19（4）：87-91.

［30］ 劉輝輝.杭白菊病毒病原鑒定及脫毒苗生物學性狀與品質性狀分析［D］.杭州：浙江大學，2015.

［31］ 王健華，王運勤，吉訓聰，等.植物病毒檢測技術研究進展［J］.熱帶農業科學，2005，25（3）：71-75.

［32］ 舒秀珍，朱水芳，胡偉貞，等.侵染菊花和風信子的番茄不孕病毒的鑒定［J］.中國病毒學，1990，5（2）：186.

［33］ HATTA T，FRANCKI R I B.Cytopathic structures associated with tonoplasts of plant cells infected with cucumbermosaic and tomato aspermy viruses［J］.Journal of General Virology，1981，53（2）：343-346.

［34］ CLARK M F，ADAMS A N.Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses［J］.Journal of General Virology，1977，34（3）：475-483.

［35］ 陳燕芳，李明福.菊花母株病毒鑒定及其莖尖組培脫毒苗的病毒檢測［J］.植物檢疫，2001，15（6）：340-341.

［36］ 吳紅芝，孔寶華，陳海如，等.侵染菊花的番茄不孕病毒的鑒定及其外殼蛋白基因的克隆［J］.中國病毒學，2002，17（2）：145-148.

［37］ 顏琛娜，王永勤，楊清，等.兩重RT-PCR同步檢測菊花B病毒和番茄不孕病毒［J］.植物保護，2009，35（3）：89-90.

［38］ SONG A，YOU Y，CHEN F，et al.A multiplex RT-PCR for rapid and simultaneous detection of viruses and viroids in Chrysanthemum［J］.Letters in Applied Microbiology，2013，56（1）：8-13.

［39］ ZHAO X T，LIU X L，GE B B，et al.A multiplex RT-PCR for simultaneous detection and identification of five viruses and two viroids infecting Chrysanthemum［J］.Archives of Virology，2015，160（5）：1145-1152.

［40］ ROBERTSC A，DIETZGEN R G，HEELAN L A，et al.Realtime RT-PCR fluorescent detection of tomato spotted wilt virus［J］.Journal of Virological Methods，2000，88（1）：1-8.

［41］ 劉興亮.菊花病毒和類病毒病原鑒定及其分子診斷方法研究［D］.北京：中國農業大學，2014.

［42］ 常小斌，劉洵，程天印，等.環介導等溫基因擴增技術及其應用研究進展［J］.畜牧獸醫科技信息，2006（12）：10-12.

［43］ FUKUTA S，OHISHIK，YOSHIDA K，et al.Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of tomato spotted wilt virus from Chrysanthemum［J］.Journal of Virological Methods，2004，121（1）：49-55.

［44］ 劉佳，黃叢林，吳忠義，等.環介導等溫擴增技術檢測菊花中番茄不孕病毒［J］.中國農業科學，2010，43（6）：1288-1294.

［45］ LIU X L，ZHAO X T，MUHAMMAD I，et al.Multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amp lification for the simultaneous detection of CVB and CSVd in Chrysanthemum［J］.Journal of Virological Methods，2014，210：26-31.

［46］ VERMA N，SHAMA A，RAM R，et al.Detection，identification and incidence of Chrysanthemum B carlavirus in Chrysanthemum in India［J］.Crop Protection，2003，22（2）：425-429.

（責任編輯：張瑞麟）

S436.8

：A

：0528-9017（2016）12-2035-04

文獻著錄格式：郭倩楠，張文芳，賈小玉，等.菊花病毒脫除及其檢測技術研究進展［J］.浙江農業科學，2016，57（12）：2035-2039.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161234

2016-08-18

國家自然科學基金（31372105）；河南師范大學大學生創新創業訓練計劃（20140134）

郭倩楠（1993—），女，河南洛陽人，在讀本科，生物科學專業，E-mail：237074891@qq.com。

趙喜亭（1971—），女，河南洛陽人，副教授，博士，從事植物生理與生物技術的教學與科研工作，E-mail：zhaoxt0411 @126.com。