甘露聚糖結合凝集素相關蛋白19(MAp19)的研究現狀①

李　婷　李　萍

(河北北方學院醫(yī)學檢驗學院病原生物與免疫學研究所，張家口075000)

?

·專題綜述·

甘露聚糖結合凝集素相關蛋白19(MAp19)的研究現狀①

李婷李萍

(河北北方學院醫(yī)學檢驗學院病原生物與免疫學研究所，張家口075000)

補體系統(tǒng)是機體固有免疫的重要組成部分，可通過經典途徑、凝集素途徑和替代途徑而被激活，發(fā)揮其生物學效應[1,2]。啟動凝集素途徑活化的第一個補體組分是甘露糖結合凝集素(Mannan-binding lection，MBL)/纖維膠原素(Ficolin，FCN)與MBL-相關絲氨酸蛋白酶(Mannose-binding lectin associated serine protease，MASP)結合形成的復合物。MASP家族由MASP-1、MASP-2、MASP-3絲氨酸蛋白酶及MAp19和MAp44非酶蛋白組成，其中MASP-2是參與凝集素途徑活化的重要組分。MAp19是MASP-2的剪切體，其氨基酸序列分析顯示僅比MASP-2羧基端前兩個功能區(qū)多四個氨基酸殘基。MAp19能與MBL結合，但無催化功能，它是否與MASP-2存在競爭抑制作用尚待進一步研究證實。此外發(fā)現MAp19與腎病、骨髓瘤以及SARS等疾病存在一定相關性。

1MASP基因及其編碼產物

人MASP-1、MASP-3和MAp44基因位于染色體3q27上，由18個外顯子組成：其中外顯子1～8、10～11編碼MASP-1/3的N端非催化結構域(即信號肽-CUB1-EGF-CUB2-CCP1- CCP2)；外顯子13～18和外顯子12分別編碼MASP-1和MASP-3的肽激活區(qū)，即連接區(qū)(Link region)SP結構域和C末端mRNA非翻譯區(qū)[3]。MAp44則是由MASP-1/3N端非催化結構域(即信號肽-CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2)和外顯子9編碼的17個氨基酸殘基構成[4]。人MASP-2和MAp19基因位于染色體1p36上，由12個外顯子組成：其中顯子1和部分外顯子2編碼一段由15個氨基酸殘基構成的信號肽，外顯子3和其余外顯子2編碼CUB1結構域，外顯子4編碼EGF結構域，外顯子6、7編碼CUB2結構域，外顯子8～11編碼CCP1和CCP2結構域，外顯子12編碼MASP-2的肽激活區(qū)，即SP結構域和C末端mRNA非翻譯區(qū)[5]。MASP-2由686個氨基酸殘基組成；MAp19是由185個氨基酸殘基組成的MASP-2剪接體，包括MASP-2N端CUB1、EGF結構域及C末端4個由外顯子5編碼的氨基酸殘基(即EQSL：谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸)和mRNA非編碼區(qū)[6]。此外采用qRT-PCR檢測發(fā)現：編碼MASP-2的mRNA只在肝臟中表達；而編碼MAp19的mRNA除在肝臟中高表達外，在腎臟和甲狀腺中也有表達。免疫組化檢測也證實MAp19在肝臟中高表達，在腎臟和甲狀腺中低表達[7]。

2MAp19的主要生物學特性

MAp19是MASP家族成員之一，它也能與MBL/FCN結合形成大分子復合物。但上述大分子復合物沒有酶活性，不能啟動凝集素途徑活化。在MAp19基因敲除小鼠中研究發(fā)現：外顯子MAp19可以通過與小鼠MASP-2 競爭結合MBL的方式，使凝集素途徑的活化下調或減弱[8]。但在人體正常生理水平下，MAp19對凝集素途徑的活化沒有減弱或抑制作用[9]。研究發(fā)現：血漿中絕大多數MASP-2以MBL/FCN-MASP-2復合物形式存在；而血漿中80%的MAp19以游離二聚體或四聚體形式存在，只有20%的MAp19能與MBL/FCN結合形成大分子復合物[10]。在MASP家族五個成員中，MAp19與MBL/FCN之間結合的親和力最低，這可能與其缺少CUB2結構域有關[11]。目前認為，能夠通過與MASP-2競爭結合MBL抑制凝集素途徑活化的MASP家族成員，可能是MAp44而不是MAp19[12,13]。

3MAp19在血、尿液中含量變化及其與疾病的關系

3.1MAp19在血、尿液中含量變化Seyfarth等[14]檢測了104例丹麥人血漿MAp19的含量，平均水平為217 ng/ml(26～675 ng/ml)，而同批次樣本中MASP-2的含量是(534±213)ng/ml。若以質量為計算標準，MAp19(平均217 ng/ml)比MASP-2(平均534 ng/ml)低。當轉換為摩爾濃度時，MAp19(19.1 kD)為11 nmol/L，MASP-2(74.2 kD)為7 nmol/L。進一步分析發(fā)現MASP -2的水平呈對數正態(tài)分布，而MAp19的水平既不呈正態(tài)分布也不呈對數正態(tài)分布，以上證實MAp19和MASP-2水平無相關性。比較同一樣本的血清和血漿，發(fā)現血漿中MAp19的含量略微高于血清(平均值分別為258 ng/ml與205 ng/ml)，且兩者的值呈高度的相關性(r2=0.88)。

MAp19的分子量很小，理論上即使是二聚體的形式也可以被腎小球濾過。對5個丹麥男性血漿和尿液樣本中MAp19的含量分析發(fā)現[15]：血漿中MAp19的平均值為204 ng/ml，24 h尿液中MAp19的平均值為63 ng/ml；而同一批樣本血液中MASP-2的平均含量是390 ng/ml，而尿液中MASP-2的平均含量小于1 ng/ml，低于檢測下限。但在同一人中，血液和尿液中MAp19的含量沒有相關性。根據人總的尿液排出體積計算MAp19在24 h排出量的平均值約為127 μg，總的排出量與血漿中的濃度也沒有相關性。進一步通過蛋白印跡發(fā)現尿液中的MAp19被部分降解，且降解的片段來源于N端。這說明MAp19并非全部直接從腎小球濾過到尿液當中，有可能存在未知的代謝機制。

3.2MAp19與疾病的關系

3.2.1MAp19與腎病Musante等[16]通過色譜結合二維電泳的方法分離局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)患兒中的血清蛋白，復性后通過大鼠腎小球生物濾過法從幾百種蛋白中獲得十種蛋白，進一步通過質譜鑒定發(fā)現其中有6種蛋白會影響腎小球的通透性，MAp19是其中之一。

Kang等[17]發(fā)現腎細胞癌患者尿液中MAp19要明顯高于健康人。用EDTA預處理尿透析液，發(fā)現可以增加MAp19的復性，表明MAp19是一種鈣結合蛋白。體外實驗證實重組MAp19對草酸鈣結晶的形成有強烈的抑制作用，且呈濃度依賴性。原因可能是MAp19羧基端富含酸性氨基酸的區(qū)域(天冬氨酸和谷氨酸)可以為與鈣離子的結合提供理想的靜電環(huán)境。因而推測存在于尿液中的MAp19可通過阻止草酸鈣在尿液中產生的作用方式，抑制腎結石的形成。

Aregger等[18]采用差異熒光凝膠電泳和蛋白質譜分析行心肺旁路手術患者術后的尿液樣本，比較差異調節(jié)蛋白發(fā)現：術后患者尿液中MAp19的含量呈約3倍上調。

3.2.2MAp19與多發(fā)性骨髓瘤房亞哲等[19]應用蛋白質組學技術篩選多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者尿液中差異表達的蛋白質。經過三氯乙酸沉淀法提取尿液蛋白質后進行雙向凝膠電泳，結果篩選出57個差異蛋白點，43個在MM組上調，14個下調。對其中30個差異蛋白點進行質譜分析，鑒定出MAp19是MM患者尿液中的差異蛋白質，且為上調蛋白。這提示MAp19可能在MM患者的免疫防御及免疫監(jiān)視中起重要作用。

3.2.3MAp19與SARS劉俊麗等[20]以全長SARS-CoVN為誘餌蛋白從人胎肝細胞cDNA文庫中篩選相互作用的分子，發(fā)現SARS-CoVN蛋白與MAp19相互作用，進一步利用免疫共沉淀試驗驗證二者間的關系。用Western blot 檢測SARS-CoV N蛋白對MAp19表達量的影響。證實SARS-CoV N蛋白與MAp19的確能夠在細胞內相互作用形成復合物，且SARS-CoV N能夠顯著提高MAp19的表達量，進而推測MAp19可能與SARS(Severe Acute Respiratory Syndromes)的發(fā)病有一定的相關性。

3.2.4MAp19與麻風病Boldt等[21]通過分析219例巴西麻風患者和495例健康志愿者血中MASP-2和MAp19的含量，并與之前報道的丹麥健康志愿者血中MASP-2和MAp19對比發(fā)現，血漿MASP-2水平的相對降低和MAp19水平的相對升高會增加人對麻風病的易感性，尤其是瘤型麻風病。因此MASP-2的基因型和血漿MASP-2、MAp19的水平有可能作為預測麻風病進展的生物學標志物之一。

4總結

MAp19是MASPS家族成員之一，起始于補體的活化研究。MAp19主要表達于肝臟，在腎臟中也可少量表達，但在尿液中的含量較高。已有研究發(fā)現MAp19與一些疾病相關，分析血液和尿液中MAp19的含量可以為臨床多種疾病的診斷提供參考依據。MAp19生物學功能如何？是簡單的腎小球濾過還是有其他的通過機制？是否具有調節(jié)和維持鈣離子體內平衡的生理功能等仍需澄清。目前對其研究十分有限，更沒有可靠的分析評價MAp19的方法。建立行之有效的檢測方法，進一步分析MAp19的作用及其含量變化與臨床相關疾病的關系，具有潛在的臨床應用價值和良好的市場前景。

參考文獻：

[1]Dunkelber JR,Song WC.Complement and its role in innate and adaptive immune responses[J]. Cell Res,2010,20(1) :34-50.

[2]周芳,賈天軍,賈曉暉.MASP-2的EGF和SP功能區(qū)蛋白表達及其多克隆抗體制備[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,28(12) :1295-1299.

[3]Degn SE,Jense L,Hansen AG,etal.Mannan-binding lectin-associated serine protease(MASP)-1 is crucial for lectin pathway activation in human serum,whereas neither MASP-1 nor MASP-3 is requried for alternative pathway function[J].J Immunol Methods,2012,189(8) :3957-3969.

[4]Héja D,Harmat V,Fodor K,etal.Monospecific inhibitors show that both mannan-binding lectin-associated serine protease-1 (MASP-1) and-2 are essential for lectin pathway activation and reveal structural plasticity of MASP-2[J].J Biol Chem,2012,287(24) :20290-20300.

[5]Degn SE,Jensen L,Gal P,etal.Biological variations of MASP-3 and MAp44,two splice products of the MASP1 gene involved in regulation of the complement system[J].J Immunol Methods,2010,361(1 /2) :37-50.

[6]Boldt AB,Grisbach C,Steffensen R,etal.Multiplex sequencespecific polymerase chain reaction reveals new MASP2 haplotypes associated with MASP-2 and MAp19 serum levels[J].Hum Immunol,2011,72(9) :753-760.

[7]Soren ED,Thiel S,Nielsen O,etal.MAp19,the alternative splice product of the MASP-2 gene[J].J Immunol Methods,2011,373(1-2):89-101.

[8]Iwaki D,Kanno K,Takahashi M,etal.Small mannose-binding lectin-associated protein plays a regulatory role in the lectin complement pathway[J].J Immunol Methods,2006,177(12) :8626-8632.

[9]Degn SE,Hansen AG,Steffensen R,etal.MAp44,a human protein associated with pattern recognition molecules of the complement system and regulating the lectin pathway of complement activation[J].J Immunol Methods,2011,183(11):7371-7378.

[10]Kjaer TR,Thiel S,Andersen GR.Toward a structure-based comprehension of the lectin pathway of complement[J].Mol Immunol,2013,56(4) :413-422.

[11]Chen CB,Wallis R.Stoichiometry of complexes between mannosebinding protein and its associated serine protea-ses.Defining functional units for complement activation[J].Biol Chem, 2001,276(28) :25894-25902.

[12]Degn SE,Andersen SH,Jensen L,etal.Assay interference caused by antibodies reacting with rat kappa light-chain in human sera[J].J Immunol Methods,2011,372(1-2) :204-208.

[13]Sren E,Degn L,Tomasz O,etal.Co-complexes of MASP-1 and MASP-2 associated with the soluble pattern-recognition molecules drive lectin pathway activation in a manner inhibitable by MAp44[J].J Immunol Methods,2013,191 :1334-1345.

[14]Seyfarth J,Garred P,Madsen HO.Extra-hepatic transcription of the human mannose-binding lectin gene (mbl2) and the MBL-associated serine protease 1-3 genes[J].Mol Immunol,2006,43(7) :962-971.

[15]Degn SE,Jensen L,Gál P,etal.Biological variations of MASP-3 and MAp44,two splice products of the MASP1 gene involved in regulation of the complement system[J].J Immunol Methods,2010,361(1-2) :37-50.

[16]Musante L,Candiano G,Bruschi M,etal.Characterization of plasma factors that alter the permeability to albumin within isolated glomeruli[J].Proteomics,2002,2(2) :197-205.

[17]Kang I,Kim JI,Chang SG,etal.Mannan-binding lectin (MBL)-associated plasma protein present in human urine inhibits calcium oxalate crystal growth[J].FEBS Lett,1999,462(1-2) :89-93.

[18]Aregger F,Pilop C,Uehlinger DE,etal.Urinary proteomics before and after extracorporeal circulation in patients with and without acute kidney injury [J].Thorac Cardiovasc Surg,2010,139(3):692-700.

[19]房亞哲,劉津.應用尿液蛋白質組技術篩選多發(fā)性骨髓瘤相關蛋白的初步研究[J].中國實驗診斷學,2011,15(4) :647-650.

[20]劉俊麗，曹誠，馬清鈞.SARS-CoV N蛋白和MAP19的相互作用[J].細胞與分子免疫學雜志，2009,25(9)：77777-77779.

[21]Boldt AB,Goeldner I,Stahlke ER,etal.Leprosy association with low MASP-2 levels generated by MASP2 haplotypes and polymorphisms flanking MAp19 Exon 5[J].PLoS One,2013,8(7) :e69054.

[收稿2015-05-16修回2015-07-20]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.030

作者簡介：李婷(1987年-)，女，碩士，主要從事固有免疫分子的檢測與臨床方面的研究，E-mail：m15350739758@163.com。 通訊作者及指導教師：李萍(1968年-)，女，碩士，教授，主要從事固有免疫分子的檢測與臨床方面的研究，E-mail：zjkliping@163.com。

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1062-03

①本文為河北北方學院校級重大課題(ZD201313)。