NF-κB在類風濕關節炎中的研究進展①

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NF-κB在類風濕關節炎中的研究進展①

姜申易魯靜

(中國醫科大學附屬第一醫院風濕免疫科，沈陽110001)

①本文為國家自然科學基金面上項目(81172867)。

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性關節滑膜炎癥為主要表現的自身免疫性疾病，損害關節軟骨、骨、關節囊，嚴重時可導致關節畸形和功能喪失，目前病因及發病機制尚未完全明確。血管翳是引起關節破壞的病理基礎，主要由新生血管、增生的滑膜細胞、炎性細胞及機化的纖維素構成，抑制血管生成的藥物被證實可有效緩解RA的病情[1]。在RA患者滑膜組織可檢測出高表達的活化的核因子(Nuclear factor，NF)

-κB[2]，NF-κB可被多種炎癥因子激活，進而上調多種炎癥因子，促進滑膜炎、骨和軟骨破壞，抑制骨和軟骨修復，促進血管翳生成。RA患者NF-κB基因表達過高，其負向調節因子基因表達過低，甲氨蝶呤可以通過影響lincRNA-p21基因降低NF-κB活性，而小干擾RNA可以進一步使NF-κB治療更具有特異性。本文就NF-κB在RA領域的研究做一綜述。

1NF-κB的分子結構

NF-κB因與B細胞中免疫球蛋白κ輕鏈增強子中的一個11堿基對序列(κB序列)的相互作用而被發現，隨后在各種類型細胞中被發現[3]。它由高度保守的Rel蛋白質家族成員兩兩結合構成同源或異源二聚體結構。Rel蛋白質家族氨基端均有一個300個氨基酸組成的序列，名為Rel同源結構域(Rel Homology Domain，RHD)[4]。RHD中含有二聚體的核定位序列(Nuclear localization sequences ，NLSs)，二聚體在此處形成，此外DNA或NF-κB抑制劑(Inhibitors of NF-κB，IκB)也在此處與NF-κB結合。哺乳動物中，Rel蛋白家族包含5個亞基：RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50；p105)、NF-κB2(p52;p100)。RelA(p65)、RelB、c-Rel含有轉錄激活結構域，所形成的的二聚體可以激活轉錄，p65/p50異源二聚體為最常見的存在形式。NF-κB1和NF-κB2被作為一個大前體合成，命名為p105和p100，分別參與NF-κB亞基的第二亞家族p50和p52的產生過程。這個過程由泛素/蛋白酶復合體通路介導，并涉及到包含錨蛋白重復序列的C端區域的選擇性降解[5]。NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)不含轉錄激活結構域，所形成的二聚體可以抑制轉錄。盡管p50和p52的同源二聚體是NF-κB的轉錄阻滯劑，但它們通過與RelA、RelB或c-Rel形成同源二聚體參與靶基因反式激活[6]。

2NF-κB的信號通路

靜止狀態下，NF-κB與一種調節性蛋白家族，即NF-κB抑制劑IκB結合，形成NF-κB-IκB復合體，以無活性狀態存在于細胞質中。IκB家族成員包括IκBα、IκBβ、IκBγ和Bcl-3。IκB對NF-κB活性的抑制作用的機制最初被認為是通過掩蓋了NF-κB二聚體的核定位序列(Nuclear localization sequences ，NLSs)，使之不能發生核移位。近期有研究指出NF-κB-IκB復合體能夠取代NF-κB的靶向DNA位點并將其轉移回細胞質內[3]。細胞質中無活性的NF-κB需要在一些炎性細胞因子等刺激作用下才能被激活，發生核移位，主要通過以下兩種途徑。

2.1經典激活途徑抑制性NF-κB激酶(Inhibitors of NF-κB kinase,IKK)復合體是一種多聚體蛋白，它的激活可以導致IκB的磷酸化。一旦磷酸化，IκB就被一種多聚體泛素連接酶泛素化，被蛋白酶體降解，p65/p50的核定位序列暴露，這時p65/p50發生核移位，連接到一系列啟動子的同源DNA序列上，并募集誘導基因表達所需要的轉錄零件。

2.2非經典激活途徑與經典激活途徑不同，非經典激活途徑主要由TNF超家族的B細胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)、CD40L、淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)

-β和病毒蛋白Tax，激活NF-κB誘導激酶(Nuclear factor-κB inducing kinase，NIK)和IKKα，使p100發生磷酸化，繼而泛素化并被降解成p52。p52再與RelB 形成二聚體，最終RelB/p52發生核移位，發揮轉錄功能[7]。

2.3激活的終止轉錄發生后，NF-κB活性的終止也是一個重要的調節步驟。最初的研究認為NF-κB活性的終止主要受IκB蛋白重復合成來調節，IκB與NF-κB重新結合促進了細胞核輸出NF-κB[8]。但有研究發現在IκBα缺失的細胞株中，p65的轉錄活性仍能在后期降低，且能被蛋白酶體抑制劑抑制[9]。另有研究發現，由組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase-1，HDAC)取代組蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltranferase,HAT)減弱了NF-κB與DNA結合的能力。轉錄共激活因子p300/CBP是NF-κB的主要乙酰化酶，具有HAT活性，可以乙酰化組蛋白的N末端，使啟動子區域的DNA機構松散，促進下游基因表達，相反HDAC起抑制作用。此外，在NF-κB激活的后期,p65通過泛素化而被降解[10]。

3NF-κB的生物學功能

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞的轉錄因子，活化的NF-κB發生核移位，與DNA增強子或啟動子結合，發揮調節轉錄的功能。NF-κB對細胞增殖的調節具有雙重作用，因能反式激活細胞周期蛋白D1和c-myc表達，可以促進細胞增殖，但又因為抑制增殖因子JNK的表達，也可抑制細胞增殖。NF-κB對凋亡的調節也具有雙重作用：NF-κB的cIAP-1和cIAP-2靶點可直接纏繞和抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，發揮抑制細胞凋亡的作用，但又因為NF-κB能夠促進壞死受體DR5、FAS配體、Bax的表達，也可促進凋亡[11]。

4NF-κB與RA

在RA患者滑膜組織可檢測出高表達的活化的NF-κB。國內學者韓飛等[12]用RT-PCR法檢測46例關節滑膜組織中p65、p50、NF-κB抑制因子等的mRNA表達，46例中RA患者17例，骨關節炎(Osteoarthritis，OA)患者24例，正常5例。結果發現RA組NF-κB 的表達及活化水平顯著高于OA組和正常組。用原位免疫組織化學染色法檢測p65的核表達，結果發現RA組p65活性系數顯著高于OA組和正常組。這些結果表明在RA患者滑膜組織中，NF-κB及其調控基因的表達和活化水平顯著增高。

在RA的病程中，眾多炎癥細胞因子參與了關節炎癥反映、軟骨破壞和滑膜血管翳的生成。NF-κB可以通過與這些炎癥細胞因子靶基因啟動子的κB位點結合，上調其轉錄水平影響RA的病程。活化的NF-κB上調TNF-α、白細胞介素(Interleukin，IL)

-1β、IL-6、IL-8、黏附分子、環氧化酶2等的轉錄水平，反過來TNF-α、IL-1β等炎癥因子又可以激活NF-κB，進一步產生TNF-α、IL-1β等炎癥因子加重RA進展。這些細胞因子中TNF-α和IL-1β在RA中發揮主要作用。TNF-α對RA的致病機制表現在以下幾點：促進內皮細胞中產生黏附分子，導致局部炎癥；刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產生前列腺素E2、膠原酶、金屬蛋白酶等，促進滑膜炎、骨和軟骨破壞，抑制骨和軟骨修復；促進內皮細胞、成纖維細胞生長因子釋放，促進血管翳形成；促使滑膜細胞、巨噬細胞、纖維母細胞和軟骨細胞產生IL-1、IL-8及TNF-α本身而加重組織損傷[13]。IL-1β與TNF-α相似，也能促進滑膜炎、骨破壞，抑制骨修復，與TNF-α發揮協同作用，共同促進RA的進展。

NF-κB促進CD4+T細胞向Th1細胞分化。CD4+T細胞在被特異性抗原提呈細胞(Antigen presenting cell，APC)提呈致敏后分化為Tho細胞，Tho細胞又在IL-4調節作用下分化為Th1和Th2細胞，IL-4在Th分化調解中起重要作用。Th1細胞通過分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β和IL-17介導細胞免疫應答，引起前炎性細胞因子產生，RA正是以Th1介導為核心的免疫系統功能紊亂性疾病。有研究用染色質免疫沉淀法檢測體內NF-κB對IL-4基因激活的關聯性，證明了在T細胞激活作用中，NF-κB連接到IL-4的啟動子上，直接影響IL-4轉錄，從而促進向Th1細胞分化[14]。NF-κB促進滑膜細胞增殖抑制其凋亡。有研究分離RA患者的滑膜成纖維細胞，用IκBα轉染，腺病毒轉染做對照，再用TNF-α刺激，用實時定量聚合酶鏈式反應(Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot)檢測是否TNF-α誘導的NF-κB控制了 FLIP在RA滑膜成纖維細胞中的表達。結果證明了TNF-α誘導的NF-κB控制了 FLIP在RA滑膜成纖維細胞中的表達，NF-κB促進了RA患者滑膜細胞的增殖，抑制其凋亡，進而導致滑膜增生，加重關節破壞[15]。

近期多項研究針對NF-κB尋求RA治療的新靶點。為觀察RA患者NF-κB及其相關基因表達水平與正常人的差異，Wang等[16]用RT-PCR檢測RA患者和正常人NF-κB負向調節因子A20黏膜相關淋巴組織淋巴瘤易位基因 (Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene，MALT)

-1、MALT-V1、A20、NF-κB 基因的表達水平。發現與健康對照相比，RA患者A20表達更低，NF-κB過表達，MALT1 和 MALT1-V表達下降。RA患者MALT1 和A20、MALT1-V1 和A20正相關，MALT1和NF-κB、MALT1-V1和NF-κB、A20 和NF-κB具有負相關趨勢。而MALT1、A20、NF-κB可能與異常T細胞活性相關。A20缺乏和MALT1紊亂在中國RA患者中廣泛存在，這是RA治療的一個新靶點。

為研究RA常用藥甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)對NF-κB活性的影響，及其可能的作用機制，Spurlock等[17]對RA中長基因間RNA-p21 (lincRNA-p21)的表達、NF-κB活性，以及對MTX的應答進行研究。發現RA患者lincRNA-p21基礎表達下降，NF-κB活性標志物磷酸化p65 (RelA)基礎表達升高。與小劑量MTX組對比，未經MTX治療組的lincRNA-p21表達水平更低，磷酸化p65表達水平更高。低水平lincRNA-p21有利于RA患者NF-κB活性。MTX通過一種DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA PKcs)依賴性機制增加了lincRNA-p21水平，從而降低了NF-κB活性的基礎水平。

為探索NF-κB的針對性治療，減少對非靶器官的影響，Zhou等[18]用6~8周雄性DBA1/J小鼠制備抗CⅡ抗體誘導的關節炎模型(CⅡ antibody-induced arthritis，CAIA)，用蜂毒肽來源的一種陽離子親水親脂性肽p5RHH與以NF-κB的p65亞基作為目標的小干擾RNA(small interfer RNA，si-RNA)結合，以非共價的自我裝配成穩定的納米復合物，使si-RNA免于失活。在CAIA模型建立第4天，給予小鼠平衡鹽溶液、游離Cy5.5標記的零亂siRNA(scrambled siRNA)或p5RHH-Cy5.5標記的零亂siRNA的納米粒。結果發現p5RHH-p65 siRNA抑制了炎癥細胞因子表達和炎癥細胞進入關節，防御了骨侵蝕，保存了軟骨的完整性，它有效的抑制了早期炎癥性關節炎，而不影響非靶器官p65表達，也不會在連續注射后引發體液應答。

5新的研究方向

IL-35作為IL-12家族的新成員，與多個免疫調控環節密切相關，在小鼠膠原誘導型關節炎(Collagen-induced arthritis，CIA)模型中可以減輕關節炎癥狀已被多次證實[19]。目前IL-35對RA非T細胞的影響尚未明確，國內學者黃斯斯等[20]對40例擴張心肌病患者進行檢測，發現這些患者IL-35及EBI3mRNA表達明顯低于正常對照組，且與紐約心臟病學會(NYHA)提出的心功能分級負相關，說明IL-35與血管生成可能相關。然而IL-35對血管生成影響的機制、信號通路尚未明確，是否可以用NF-κB信號通路解釋其對血管生成的作用機制，是否可以從抑制血管翳形成這一新的角度來解釋IL-35減輕CIA關節炎癥狀的原理，可以作為NF-κB在RA領域的一個新的研究方向。

6小結

NF-κB作為一種核轉錄因子，可以調節多種細胞因子、黏附因子、趨化因子、生長因子、氧化應激相關酶等的表達，在細胞分化、細胞凋亡、細胞黏附、炎癥及免疫應答等方面影響RA的發生、發展。目前NF-κB在RA領域的研究已經取得了一些進展，然而針對NF-κB的靶向治療還有諸多問題有待探討。

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[收稿2014-12-01修回2015-01-12]

(編輯倪鵬)

通訊作者及指導教師：魯靜(1963年-)，女，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事類風濕關節炎發病機制方面的研究，E-mail:lujingtan@163.com。

作者簡介：姜申易(1989年-)，女，在讀博士，主要從事類風濕關節炎發病機制方面的研究，E-mail:jaddison@163.com。

中圖分類號R593.32

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0119-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.028